原代胚胎成纖維細(xì)胞培養(yǎng)

一、實(shí)驗(yàn)器材：

手術(shù)小直剪刀三把、眼科直鑷子三把、眼科彎鑷子兩把、玻璃平 皿三套、200目尼龍濾網(wǎng)、50ML、15ML離心管和手術(shù)刀片。以上物品均需要高壓滅菌消毒處理。

二、實(shí)驗(yàn)試劑：

無Ca+2和Mg+2的PBS、0.05%胰酶0.53mmol/L EDTA溶液、小鼠胚成纖維細(xì)胞（MEF）生長培養(yǎng)基:高糖DMEM加10%FCS。

三、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：

孕期14至16天的孕鼠

四、實(shí)驗(yàn)步驟：

1、處死孕鼠，置于75%酒精里全身浸泡，然后在超凈臺(tái)中用一把剪刀和一把鑷子把孕鼠外皮剪開，用另外一把剪刀和一把鑷子把內(nèi)皮剪開，露出子宮，最后用第三把剪刀和鑷子將子宮小心取出放在盛有PBS的玻璃平皿中，沖洗去血。

2、用兩把彎鑷子將胚胎外的胞膜小心去除，然后夾掉頭和內(nèi)臟，將其余胚胎轉(zhuǎn)移到一個(gè)裝有30MLPBS的50ML離心管中，輕輕顛倒兩次，倒掉PBS，再重復(fù)此步驟一次，留少許PBS將胚胎轉(zhuǎn)移到另一裝有PBS的平皿中，用手術(shù)刀片將其細(xì)細(xì)切碎。

3、用200ul的移液槍反復(fù)快速吹打平皿中的液體，放在15ML離心管中，4℃1500rpm離心5分鐘，倒掉上清，加10ML胰酶，重懸沉淀，放37℃水浴中消化30分鐘，且每隔五分鐘輕輕晃動(dòng)，使之充分消化。

4、將上層細(xì)胞懸液倒入一裝有10MLMEF生長培養(yǎng)基的50ML離心管中，用200目尼龍濾網(wǎng)過濾后，1500rpm離心5分鐘收集細(xì)胞。30ML　MEF生長培養(yǎng)基洗滌兩次（此步驟中作者試過用無血清的培養(yǎng)基洗滌，結(jié)果無差別）。

5、細(xì)胞沉淀用15ML生長培養(yǎng)基懸起，細(xì)胞計(jì)數(shù)（八只14天胎鼠可獲得2-3×107細(xì)胞）。

6、3×106細(xì)胞懸浮于15ML MEF生長培養(yǎng)基中，接種到200ML的培養(yǎng)瓶中。

7、24小時(shí)后更換新鮮的MEF生長培養(yǎng)基。

8、細(xì)胞長滿后，先用PBS沖洗，倒掉，加胰酶消化（此步時(shí)間不宜過長，作者一般不超過五分鐘），按1：5傳代。

9、細(xì)胞再次長到覆蓋率80-90%左右，將其消化后，常規(guī)凍存。（凍存液要現(xiàn)配）

五、討論：

1、原代培養(yǎng)，一定要避免污染。

2、MEF生存能力有限，如果不凍存，體外存活十代左右。

3、凍存后復(fù)蘇的細(xì)胞只能傳代一次，因?yàn)檫@些細(xì)胞繁殖能力有限。

4、消化細(xì)胞時(shí)間不要過長。

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