淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化

實(shí)驗(yàn)步驟

采血：

需要在嚴(yán)格無(wú)菌條件下采血。肝素抗凝，室溫保存，24hr-72hr轉(zhuǎn)化效率高。也有保存更長(zhǎng)時(shí)間，采血后不要將血液置冰箱中，長(zhǎng)途運(yùn)輸也不要冷藏。

分離淋巴細(xì)胞：

采集血液4-5mL，與2mL1640（含1%雙抗）在離心管內(nèi)混合，然后緩慢沿管壁注入淋巴分離液（已37℃預(yù)熱），3000rpm離心30min。

收集白細(xì)胞層，轉(zhuǎn)移至另一離心管中，加入10mL1640（含1%雙抗），輕輕吹打均勻，1500 rpm離心15min。棄上清，如此反復(fù)洗滌3次，收集白細(xì)胞。

轉(zhuǎn)化

取1 mL全培養(yǎng)基（+0.5%pHA）加入已經(jīng)洗滌三次的白細(xì)胞離心管中，輕輕吹打均勻，轉(zhuǎn)入24孔板中，加入自備EBV液0.6mL，20ug/ mL環(huán)孢霉素0.2 mL，放入37℃5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

3-4天后觀察細(xì)胞，鏡下可見(jiàn)集合的細(xì)胞團(tuán)，以及已被轉(zhuǎn)化的明顯增大的類淋母細(xì)胞，4-5天后可加入0.5 mL全培養(yǎng)基（1640+15%FBS+1%雙抗+1.6%1M Hepes），然后視細(xì)胞生長(zhǎng)情況更換培養(yǎng)基，并且轉(zhuǎn)入培養(yǎng)瓶中。

附：

EBV液制備：

培養(yǎng)B95-8細(xì)胞，待細(xì)胞長(zhǎng)滿，培養(yǎng)基變黃，收集于50mL離心管中，于-80℃冰箱中，過(guò)夜，37℃水浴融化，再置于-80℃冰箱中，如此反復(fù)凍融三次，2000 rpm離心20min，上清0.2um過(guò)膜，-80℃冰箱中凍存?zhèn)溆谩?/span>

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