正常人臍靜脈原代內皮細胞培養
一、實驗試劑
1、培養基： PriCells Medium + 10% FBS + 1% P/S + PriCells Supplem e nt
2、凍存液： PriCells Medium + 20% FBS + 10% DMSO
3、洗滌液： 1 × PBS （pH 7.4 ） + 1% P/S
4、染色液： 0.4% Trypan Blue
5、消化液： PriCells Isolation of Primary Cell Kit
6、檢測試劑：抗人 Ⅷ 因子抗體，熒光標記二抗，乙醇丙酮混合液（1 ： 1 ）
二、實驗器械
1、培養皿
2、培養瓶
3、直剪和眼科剪
4、眼科鑷和止血鉗
5、 10ml 注射器
6、玻璃滴管
7、燒杯
8、 15ml 離心管
三、實驗流程
取材
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洗滌臍帶外血漬, 將膠帶剪為15cm 左右長
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PBS 灌 洗，去掉淤血
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推注空氣，排出殘存 1 × PBS （pH 7.4 ）
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注射器灌注消化液（PriCells ），至另一端有消化液流出時用止血鉗截斷，繼續灌注消化液至 血管充盈用另一止血鉗截斷此端，放置到含抗生素 1 × PBS （pH 7.4 ） 燒杯中
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燒杯放置到37℃ ， 15-20min 水浴 恒溫消化，間隔 2-3min 搖動
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收集消化液，用培養基洗滌靜脈3-4 次， 3ml/ 次，之后加入消化終止液（ PriCells ）反應
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離心，1000rmp,10min，棄去上清
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重懸，計數細胞
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接種 密度以5 × 10 5 個/ml
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培養37℃ ， 5%CO 2
四、實驗操作
1、培養瓶預包被。試驗前一天預包培養瓶，置于超靜臺吹干或 45℃ 烘箱烘干（切記保持無菌）， 4℃ 冰箱放置，備用。
2、取材：正常分娩胎兒臍帶，長 15-20cm 。
3、材料預處理：將獲取的血管放入含有 1% P/ S 的 1 × PBS （pH 7.4 ） 中反復洗滌，去除臍帶外部的血漬，之后用注射器吸取洗滌液反復灌住沖洗臍帶靜脈血管，至血管內無血漬，洗滌液澄清為止。
4、消化液：用注射器關注空氣推注入血管中，排出殘余洗滌液，在從血管一端開口處注入消化液 ，當另一開口端有消化液流出即可用止血鉗結扎血管，繼續灌注消化液，到血管充盈為止，同樣用止血鉗截流血管，放入含無菌PBS的燒杯中37 ℃水浴 消化30min。
5、終止消化：去掉止血鉗，讓酶液流入預先準備好的培養皿中，按1：1加入消化終止液，中止酶反應，用培養基灌注血管清洗3次。
6、收集重懸細胞：收集中止后的消化液于離心管中， 1000 rpm ，離心 10 min ，棄去上清，加入培養液重懸，染色計數細胞。
7、培養細胞密度：調整細胞密度以 5 × 10 5 個/ml 接種入培養瓶。
8、培養：放置于 37℃ ， 5% CO 2 培養箱中。
五、細胞鑒定
1、顯微鑒定：相差顯微鏡下，可見細胞呈梭狀，細胞密度增高后呈現鵝卵石樣鑲嵌排列，有接觸抑制的特點。細胞具備良好的透光性。
2 、免疫組織化學鑒定 ：利用 Ⅷ因子相關抗原檢測（或利用CD31和CD33免疫熒光染色鑒別內皮細胞）。
3、細胞爬片。將洗凈的蓋玻片放入 6 孔培養板中，接種細胞為 3 ×10 4 個/ 孔， 48 小時候細胞可以長滿，用鑷子取出
鋪滿細胞的蓋玻片備用。
4、細胞固定：用 PBS 洗滌細胞，之后放入乙醇丙酮混合液中，固定 10min ，空氣中自然干燥。
5、特異性抗體：按照說明書稀釋比要求稀釋抗體，加入抗體，放置 37℃ 孵育 60min 。
6、洗滌： 1 × PBS （pH 7.4 ） 洗滌3 次 × 15 分鐘 ，晾干。
7、標記性抗體：加入熒光標記抗體， 37℃ 孵育 30min 。 洗滌： 1 × PBS （pH 7.4 ） 洗滌3 次 × 15 分鐘 ，晾干。
8、封片：封片劑封片。
9、鏡檢：熒光顯微鏡下觀察，內皮細胞包質呈現較強黃綠色熒光，細胞核周圍尤其明顯。
六、注意事項
1、選材注意選取圓潤飽滿無扭曲變形的臍帶，臍帶血管中無血塊凝固阻塞，臍帶長度大于 15cm 。取材過程盡可能保證無菌，若距離實驗室比較遠，可以將獲取的臍帶先用含有抗生素的 PBS 洗滌去除殘血，之后浸泡到此洗滌液中，低溫冰盒帶回實驗室。
2、注意盡可能消除血管內的殘血，避免血細胞及某些血清成分對內皮細胞貼壁的影響。
3、內皮細胞分離損傷嚴重影響內皮細胞的生長，因此應嚴格掌握好酶的消化濃度和消化時間。
4、嚴格控制內皮細胞培養條件。包括細胞培養用液（培養基，生長因子，血清，抗生素）的質量，濃度。
5、關于培養瓶包被與否，有文獻研究顯示包被與未包被之間沒有特別大的差異。 實驗中，可以酌情考慮是否包被。
6、傳代培養細胞接種量為 5 ×10 4 個（25 cm 2 培養瓶），細胞倍增時間為48 小時。細胞傳代培養最佳為 5-8 代， 傳代次數增加，細胞體積增大，細胞之間間隙增加，細胞貼壁牢固，傳代消化時間會有所延長。
七、 PriCells 細胞圖片
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