細(xì)胞培養(yǎng)的一般技術(shù)
促細(xì)胞分裂劑激活單核細(xì)胞
基本原理 ：
本方法是通過促細(xì)胞分裂劑與細(xì)胞表面受體相互作用，在體外觸發(fā)細(xì)胞的多克隆激活。根據(jù)所使用的促細(xì)胞分裂劑的不同，應(yīng)答細(xì)胞可以是T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞，或兩者同時，或者是單核細(xì)胞。 細(xì)胞激活可以通過細(xì)胞增殖、細(xì)胞因子分泌、表面抗原表達(dá)和/或細(xì)胞體積的增加進(jìn)行檢測。例如在使用B細(xì)胞激活劑時，可以通過多克隆免疫球蛋白的分泌進(jìn)行檢測。
表1 常用的促細(xì)胞分裂劑和多克隆淋巴細(xì)胞激活劑
促細(xì)胞分裂劑 所 用 濃 度 應(yīng) 答 細(xì) 胞
刀豆蛋白AConA 1- 10 μg/ml T 淋巴細(xì)胞
植物凝集素PHA 1-5 μg/ml T 淋巴細(xì)胞
佛波醇酯PMA 1-10 ng/ml T 淋巴細(xì)胞
婁諾霉素+PMA 100-500 ng/ml T 淋巴細(xì)胞
脂多糖LPS 2-25 μg/ml 鼠B細(xì)胞（T不依賴型），單核細(xì)胞
美洲商陸PWN 試驗測定 人B細(xì)胞（T依賴型）
葡萄球菌A，SAC 1/1000-1/10000 人B細(xì)胞
試劑和設(shè)備：
細(xì)胞懸浮液；
96孔平底組織培養(yǎng)板；
含血清培養(yǎng)基（通常為 RPMI 1640,含10% 胎牛血清，100U/ml青霉素，100μg/ml鏈霉素）；
促細(xì)胞分裂劑（見表1），要求純品或半純品，有市售商品；
多通道移液器和微量移液器；
帶570nm濾片的酶標(biāo)儀；
超凈工作臺；
CO2孵箱；
冷凍離心機(jī)。
操作步驟：
（一）促細(xì)胞分裂劑制備
根據(jù)說明書將促細(xì)胞分裂劑重新溶解于水或培養(yǎng)液中，制成儲存液（如100′），保存于-20℃。
（二）促細(xì)胞分裂劑滴定
1、在培養(yǎng)液中稀釋儲存液到所需的第一個濃度，通常為理論最佳濃度的10倍；
2、在培養(yǎng)板或試管中直接將促細(xì)胞分裂劑進(jìn)行濃度遞減系列稀釋（100 μl/孔）；
3、每孔平行重復(fù)三次；
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