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細胞試驗基本方法
發布日期:2023-07-04 09:43:08


細胞試驗基本方法


單核細胞的分離


基本原理


本文分離單核細胞所用方法是Percoll非連續性密度梯度離心法,主要是根據不同細胞間密度的差別進行細胞分離。此法易操作,且使用通常的實驗設備即可完成。


試劑與器材


·外周血單個核細胞(參見實驗1)
  ·PBS1×和PBS10×(無Ca2+、Mg2+),含0.5mM EDTA
  ·胎牛血清(56℃,30分鐘加熱滅活)
  ·HCl1mol/l
  ·Percoll分層液(密度=1.130g/ml,商品)
  ·4g/l臺盼藍染液(溶解在PBS液中)
  ·50ml聚丙烯圓錐管
  ·毛細吸管
  ·移液管(1、2、10ml)
  ·CO2孵箱
  ·超凈臺
  ·有旋轉桶轉子裝置的離心機
  ·PH計


操作步驟


所有的操作應該在無菌條件下進行


(一)不同密度Percoll分層液的配制


1.Percoll分層液儲備液的制備:取未稀釋的Percoll原液(從瓶中取)9ml+1ml PBS 10×(無Ca2+、Mg2+),用HCl1PH至7.4


2. Percoll分層液(Ⅰ)(密度=1.080g/ml)的配制:取Percoll儲備液3.12 ml(前一步配制)+1.88 ml PBS1×(無Ca2+、 Mg2+)


3. Percoll分層液 (Ⅱ)(密度=1.069g/ml)的配制:取Percoll分層液(Ⅰ)2.68 ml+2.32ml PBS 1×(無Ca2+、Mg2+)


4. Percoll分層液(Ⅲ)(密度=1.060g/ml)的配制:取Percoll分層液(Ⅱ)2.32 ml +2.68 ml PBS 1×(無Ca2+、Mg2+)


(二)不連續密度梯度制備


1. 將洗滌過的8×107外周血單個核細胞重新懸浮在2ml的Percoll分層液(Ⅰ)(密度=1.080g/ml)在這層液體的表面上輕輕鋪上2ml Percoll分層液(Ⅱ)(密=1.069g/ml),后再于第二層液面上輕輕鋪上2ml的Percoll分層液(Ⅲ)(密度=1.060g/ml)


2. 20℃,在旋轉轉子中1000×g離心上步所形成的密度梯度90分鐘(慢慢增加速度,無制動停轉)。


(三)單核細胞的分離


1. 離心后單核細胞存在于Percoll分層液(Ⅱ)和(Ⅲ)(密度較小的部分)之間的界面中。


2. 用毛細吸管仔細收集單核細胞。


3. 用含1-5%胎牛血清的PBS 1×液洗滌細胞3次,4℃,400×g離心5分鐘,棄上清液。


4. 若需要進一步實驗,將細胞重新懸浮于培養基中。


5. 用臺盼藍拒染法測定細胞存活率。


結果:本法回收的細胞中單核細胞占70-100%(存活率應大于90%),淋巴細胞占0-20%,粒細胞占0-5%,紅細胞占0-7%,血小板小于0.5%。


實驗要點


1.為了得到較好的結果,外周血單個核細胞分離后應立即使用。


2.所有操作過程應在18-20℃中進行。


3.仔細覆蓋各種Percoll分層液,避免破壞其界面。


4.洗滌分離細胞3次,以除去殘存的Percoll分層液和血小板。


5.如果所制備的細胞仍不純,可使用包被有抗CD2、抗CD3、抗CD19抗體分子的磁珠, 以除去殘存的NK、T、B淋巴細胞。




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