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細胞培養常見問題與分析
發布日期:2023-07-04 09:33:29


細胞培養常見問題與分析


1. 冷凍管應如何解凍?


取出冷凍管后, 須立即放入37 ℃水槽中快速解凍, 輕搖冷凍管使其在1 分鐘內全部融化, 并注意水面不可超過冷凍管蓋沿, 否則易發生污染情形。另冷凍管由液氮桶中取出解凍時, 必須注意安全, 預防冷凍管之爆裂。


2. 細胞冷凍管解凍培養時, 是否應馬上去除DMSO?


除少數特別注明對DMSO 敏感之細胞外, 絕大部分細胞株(包括懸浮性細胞), 在解凍之后, 應直接放入含有10-15 ml新鮮培養基之培養角瓶中, 待隔天再置換新鮮培養基以去除DMSO 即可, 如此可避免大部分解凍后細胞無法生長或貼附之問題。


3. 可否使用與原先培養條件不同之培養基?


不能。每一細胞株均有其特定使用且已適應之細胞培養基, 若驟然使用和原先提供之培養條件不同之培養基, 細胞大都無法立即適應, 造成細胞無法存活。


4. 可否使用與原先培養條件不同之血清種類?


不能。血清是細胞培養上一個極為重要的營養來源, 所以血清的種類和品質對于細胞的生長會產生極大的影響。來自不同物種的血清, 在一些物質或分子的量或內容物上都有所不同,血清使用錯誤常會造成細胞無法存活。


5. 何謂FBS, FCS, CS, HS ?


FBS (fetal bovine serum) 和FCS (fetal calf serum) 是相同的意思, 兩者都是指胎牛血清, FCS 乃錯誤的使用字眼, 請不要再使用。CS (calf serum) 則是指小牛血清。HS (horseserum) 則是指馬血清。


6. 培養細胞時應使用5 % 或10% CO2?或根本沒有影響?


一般培養基中大都使用HCO3-/CO32-/H+ 作為pH 的緩沖系統, 而培養基中NaHCO3 的含量將決定細胞培養時應使用的CO2 濃度。當培養基中NaHCO3 含量為每公升3.7 g 時,細胞培養時應使用10 % CO2;當培養基中NaHCO3 為每公升1.5 g 時, 則應使用5 % CO2 培養細胞。


7. 何時須更換培養基?


視細胞生長密度而定, 或遵照細胞株基本數據上之更換時間,按時更換培養基即可。


8. 培養基中是否須添加抗生素?


除于特殊篩選系統中外, 一般正常培養狀態下, 培養基中不應添加任何抗生素。


9. 附著性細胞繼代時所使用之trypsin-EDTA 濃度?應如何處理?


一般使用之trypsin-EDTA 濃度為0.05% trypsin-0.53mMEDTA.4 Na。第一次開瓶后應立即少量分裝于無菌試管中, 保存于-20 ℃,避免反復冷凍解凍造成trypsin 之活性降低, 并可減少污染之機會。


10. 懸浮性細胞應如何繼代處理?


一般僅需持續加入新鮮培養基于原培養角瓶中, 稀釋細胞濃度即可, 若培養液太多時, 可將培養角瓶口端稍微抬高, 直到無法容納為止。分瓶時取出一部份含細胞之培養液至另一新的培養角瓶, 加入新鮮培養基稀釋至適當濃度, 重復前述步驟即可。


11. 欲將一般動物細胞離心下來,其離心速率應為多少轉速?


欲回收動物細胞, 其離心速率一般為300xg (約1,000 rpm),5 - 10 分鐘, 過高之轉速, 將造成細胞死亡。


12. 細胞之接種密度為何?


依照細胞株基本數據上之接種密度或稀釋分盤之比例接種即可。細胞數太少或稀釋的太多亦是造成細胞無法生長之一重要原因。


13. 細胞冷凍培養基之成份為何?


動物細胞冷凍保存時最常使用的冷凍培養基是含5 - 10 %DMSO (dimethyl sulfoxide) 和90 - 95 % 原來細胞生長用之新鮮培養基均勻混合之。注意:由于DMSO 稀釋時會放出大量熱能, 故不可將DMSO 直接加入細胞液中, 必須使用前先行配制完成。


14. DMSO 之等級和無菌過濾之方式為何?


冷凍保存使用之DMSO 等級, 必須為Tissue culture grade之DMSO (如Sigma D2650), 其本身即為無菌狀況, 第一次開瓶后應立即少量分裝于無菌試管中, 保存于4°C, 避免反復冷凍解凍造成DMSO 之裂解而釋出有害物質, 并可減少污染之機會。若要過濾DMSO, 則須使用耐DMSO 之Nylon 材質濾膜。


15. 冷凍保存細胞之方法?


冷凍保存方法一: 冷凍管置于4℃ 30~60 分鐘→ (-20 ℃30 分鐘*) → -80 ℃16~18 小時(或隔夜) → 液氮槽vaporphase 長期儲存。


冷凍保存方法二: 冷凍管置于已設定程序之可程序降溫機中每分鐘降1-3 ℃ 至-80 ℃ 以下, 再放入液氮槽vapor phase長期儲存。*-20 ℃不可超過1 小時, 以防止冰晶過大,造成細胞大量死亡,亦可跳過此步驟直接放入-80℃ 冰箱中,惟存活率稍微降低一些。


16. 細胞欲冷凍保存時, 細胞冷凍管內應有多少細胞濃度?


冷凍管內細胞數目一般為1x106 cells/ml vial, 融合瘤細胞則以5x106 cells/ml vial 為宜。



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