細胞培養面面觀

1、首先說清洗：對于玻璃器皿（如移液管、蓋玻片之類）可先用酸液浸泡24h以上，再用清水浸泡24h。之后用清水將移液管沖洗10遍，除去殘留酸液，再用雙蒸水沖洗3-5遍，徹底洗凈后放入不銹鋼筒中，雙層牛皮紙扎口，高壓滅菌20min，烘干待用。

我們實驗室的酸液一般是次強酸液（重鉻酸鉀120g 濃硫酸200 mL 蒸餾水1 000 mL）配液時要小心燙傷。

裝培養基的瓶子則要在每次用完培養基以后就要立即洗凈，臨用時再次用清水沖洗3-5遍，再用雙蒸水漂洗3次，洗凈后瓶口蓋上錫箔紙，外包雙層牛皮紙扎口后高壓滅菌20min，與其配套的瓶蓋則洗凈后另行包好同時滅菌、烘干。

培養基過濾器滅菌同瓶子，也要在用完后及時洗凈、滅菌時保持密封。Tip頭就容易了，插到盒子里，雙層牛皮紙包好后直接高壓滅菌就好了。

2、再說說除菌：我說的除菌主要是指溶液的除菌。如PBS、HEPES之類的一些緩沖劑和不含葡萄糖的鹽溶液，可以配好以后直接高壓滅菌。而大部分的溶液由于成分限制必須過濾除菌。我們實驗室需要過濾除菌的溶液有：膠原酶、胰酶、各類血清、抗生素、G-418溶液、各類培養基、各類生長因子、丙酮酸鈉、谷氨酰胺等。

3、關于各類溶液的配制：我列出我們實驗室常用試劑的配方

1XPBS：氯化鈉8克、氯化鉀0.2克、磷酸二氫鈉1.15克、磷酸氫二鉀0.2克，加水至一升，調pH=7.4。這里我認為PBS的pH是最重要的一環，不可大意。

HEPES溶液：8克氯化鈉、0.3克氯化鉀、0.135克磷酸氫二鈉、1克葡萄糖、5克HEPES加水900ml，調pH=7.4

抗生素：我們主要用青霉素和鏈霉素，一般用1XPBS稀釋至1X105單位，-20度儲存，用時直接加入培養基，工作濃度一般為1X102單位。

G-418：1克包裝的G-418瓶中加入10mlHEPES溶液徹底溶解，過濾除菌后分裝于EP管，-20度保存。

谷氨酰胺：L-谷氨酰胺29.2克，加Hanks‘BBS1000ml溶解，配成200mmol/L過濾除菌，4度保存，工作濃度1～4mmol/L。加有谷氨酰胺的培養液在4℃冰箱中儲存2周以上時，應重新加入原來的谷氨酰胺。

1XEDTA-胰酶：0.25克胰酶加0.1克EDTA完全溶解于500ml 1XPBS中，過濾除菌后分裝于50ml離心管中，一管4度備用，其他-20度保存。我不太主張配成10X的母液，因為胰酶反復凍融后，效果會差很多。（EDTA很難溶，必要時候可放置過夜）

MTT：sigma公司出產，用1XPBS配成50mg/ml待用。MTT毒性很大，配置時務必小心。

各類培養基：現在我們實驗室都是買GIBICO的粉劑自己配制。包裝盒上會有配制方法，以及加碳酸氫鈉的量。按說明來就是了。需要注意的是在配培養基前，最好先確保碳酸氫鈉充分溶解，避免局部pH偏高或偏低。SmileSmile

再一個就是水的使用，一般配鹽溶液，用三蒸水即可，而配制培養基務必用超純水，并在使用前要高壓滅菌。

4、關于培養基的選用：我養過的細胞株不多，權當拋磚引玉吧。

一般來說大部分細胞系我們都用高糖DMEM+10%FCS培養，我們實驗室用該培養基的有：HepG-2、NIH-3T3、A549、Hela、C2C12、COS-7。特殊的，如P19Cl6用α-MEM+10%FCS，SGC-7901用RPMI-1640+10%FCS，293細胞則用MEM+熱滅活的馬血清。

對于貼壁不是很緊的細胞，用45%DMEM+45%α-MEM+10%FCS有奇效~

5、操作中的一些小細節

實驗進行前，無菌室及無菌操作臺以紫外燈照射30分鐘滅菌，以70 %ethanol 擦拭無菌操作抬面，并開啟無菌操作臺風扇運轉數分鐘后，才開始實驗操作。每次操作只處理一株細胞株，以避免失誤混淆或細胞間污染。

實驗完畢后，將實驗物品帶出工作臺，以70 % ethanol 擦拭無菌操作抬面。操作間隔應讓無菌操作臺運轉5分鐘以上后，再進行下一個細胞株之操作。

無菌操作工作區域應保持清潔及寬敞，必要物品，例如試管架、吸管吸取器或吸管盒等可以暫時放置，其它實驗用品用完即應移出，以利于氣流之流通。實驗用品以70 % ethanol 擦拭后才帶入無菌操作臺內。

實驗操作應在抬面之中央無菌區域，勿在邊緣之非無菌區域操作。

小心取用無菌之實驗物品，避免造成污染。勿碰觸吸管尖頭部或是容器瓶口，亦不要在打開之容器正上方操作實驗。容器打開后，以手夾住瓶蓋并握住瓶身，傾斜約45° 角取用，盡量勿將瓶蓋蓋口朝上放置桌面。

定期檢測下列項目： CO2 鋼瓶之CO2 壓力 、CO2 培養箱之CO2 濃度、溫度、及水盤是否有污染(水盤的水用無菌水，每周更換)、無菌操作臺內之airflow 壓力，定期更換紫外線燈管及HEPA 過濾膜，預濾網(300小時/預濾網，3000 小時/HEPA)、液氮罐中的液氮高度。

水槽可添加飽和硫酸銅溶液，并定期換水。

6、血清的相關問題

血清必須貯存于–20℃，若存放于4℃，不要超過一個月。如果一次無法用完一 瓶，可將40～45 ml 分裝于無菌50 ml 離心管中，預留此膨脹體積之空間，以免容器凍裂。

一般廠商提供之血清為無菌，不需再無菌過濾。若發現血清有許多懸浮物，則可將血清加入培養基內一起過濾，勿直接過濾血清。

瓶裝(500ml) 血清一定要逐步解凍: 4℃冰箱溶解一天，至室溫下全溶后再分裝，在溶解過程中須規則搖晃均勻(小心勿造成氣泡)，使溫度與成分均一，減少沉淀的發生。勿直接由–20℃直接至37℃解凍，因溫度改變太大，容易造成蛋白質凝結而發生沉淀。

熱滅活是指56℃, 30 分鐘加熱已完全解凍之血清。加熱過程中須規則搖晃均勻。此熱處理之目的是使血清中之補體成份 去活化。除非必須，一般不要作此熱處理，因為會造成沉淀物之顯著增多，且會影響血清之品質。以我們實驗室做的對照試驗看，未滅活血清效果的確要好些。

7、貼壁細胞傳代培養

一般步驟為：真空泵吸走培養基，1XPBS漂洗兩次，加入1mlEDTA-Tripsin（100mm皿為例），37度放置數分鐘，輕拍培養瓶使細胞自瓶壁脫落，加入適量血清，以吸管上下吸放數次以打散細胞團塊，離心后加入新鮮培養基，按比例轉移至新皿。

細胞的傳代最重要的是胰酶處理時間，若胰酶處理太久，容易造成細胞貼壁不緊，顯微鏡下觀察立體感不強，嚴重的時候甚至會造成細胞死亡。我談談個人經驗：HepG-2、A549、Hela、SGC-7901幾種癌細胞處理時間可適當放長，一般處理5-6min，C2C12、COS-7、NIH-3T3比較容易脫落，2min足矣，P19Cl6和293細胞貼壁不緊，可在PBS漂洗后，直接換新鮮培養基打散。

8、細胞凍存及復蘇

首先說凍存液配方，常用的配方一般是兩種——90%FCS+10%DMSO或70%培養基+20%FCS+10%DMSO。前一種較貴，而且后一種凍存效果也不錯，因此本人一般選用第二種配方。對于比較脆弱的細胞則選用前一種凍存液。

凍存步驟比較簡單，前期處理同細胞傳代，只是在離心后是直接吸取上清，用手拍打離心管底部，加入適量凍存液使細胞完全懸浮后分裝于凍存管。

制后先將凍存管放入4℃冰箱，約40min。 接著置于-20℃冰箱，約60min。置于-80超低溫冰箱中放置過夜。 最后置于液氮罐中長期保存。 同時做好凍存記錄，在自己的筆記本和凍存記錄本上均要記錄。

注意事項：

1>使用DMSO前，不需要進行高壓滅菌，它本身就有滅菌的作用。高壓滅菌反而會破壞它的分子結構，以至于降低冷凍保護效果。

2>凍存時要選處于對數生長期的細胞，這樣效果要好很多

3>不宜將凍存細胞放置在0℃～-60℃這一溫度范圍內過久，低溫損傷主要發生在這一溫度區內，是“危險溫區”。

4>注意定期檢查液氮罐內液氮量，及時添加。

5>凍存液中的培養基要與培養時相同，避免細胞由于環境突然改變而死亡，在凍存管上也要標明培養基種類。

6>凍存液不要預熱。

7>程序凍存盒非常好用，省事省時效果還好，強烈推薦凍存使用凍存盒。

細胞復蘇的原則是快速融化：必須將凍存在-196℃液氮中的細胞快速融化至37℃，使細胞外凍存時的冰晶迅速融化，避免冰晶緩慢融化時進入細胞形成再結晶，對細胞造成損害。

具體步驟：

1.將水浴鍋預熱至40℃

2.用75％酒精擦拭紫外線照射30min的超凈工作臺臺面。

3.在超凈工作臺中按次序擺放好消過毒的離心管、吸管、培養瓶等等。

4.根據細胞凍存記錄按標簽找到所需細胞的編號。

5.從液氮罐中取出細胞盒，取出所需的細胞，同時核對管外的編號。

6.迅速將凍存管投入到已經預熱的水浴鍋中迅速解凍，并要不斷的搖動，使管中的液體迅速融化。

7.約1-2min后凍存管內液體完全溶解，取出用酒精棉球擦拭凍存管的外壁，

8.平衡后，放入離心機中3000r/min 離心3min

9.吸棄上清液。

10.向凍存管內加入1ml培養液，吹打制成細胞懸液。

最后將細胞懸液分裝入培養瓶內，將培養瓶放入37℃和5％CO2的培養箱內12-24小時后換液繼續培養培養，換液的時間由細胞情況而定。

注意事項：

1>復蘇時選用的培養基要符合凍存管上標明的培養基。2>操作人員應戴防護面罩及手套，防止冷凍管可能爆裂之傷害。3>自液氮或干冰容器中取出冷凍管，檢查蓋子是否旋緊，由于熱脹冷縮過程，此時蓋子易松掉。

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