膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)（astrocyte, oligodendrocyte）

取材及膠質(zhì)細(xì)胞的混合培養(yǎng)

1、P2 SD大鼠經(jīng)低溫麻醉后以碘酒和75％乙醇消毒，無菌操作下，斷頭放入預(yù)冷的D-Hanks液中，在解剖顯微鏡下取大腦皮層并除去腦膜。

2、剪碎組織成1mm3大小，加入胰酶-EDTA消化液并放入37℃孵箱內(nèi)消化20min，中間搖晃一次。

3、隨后用滴管吸出組織轉(zhuǎn)移到裝有預(yù)冷的MEM＋10％FBS（Glial Medium，GM）的離心管內(nèi)終止消化液作用5min。

4、吸出組織轉(zhuǎn)移到另一支裝有冷的GM的離心管內(nèi)，用火焰拋光的巴斯德滴管吹打數(shù)次，靜置后取上清并吸到另一支離心管內(nèi)。重復(fù)上述步驟2～3次。

5、所得上清于800r/min離心5min，棄上清，管內(nèi)加入新鮮GM并吹打成單細(xì)胞懸液。細(xì)胞計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞密度按1.5×105/cm2種入25cm2培養(yǎng)瓶，放入孵箱培養(yǎng)。以后每隔2～3d進(jìn)行全量換液。

搖床振搖分離星形膠質(zhì)細(xì)胞和寡突膠質(zhì)細(xì)胞

培養(yǎng)至7～10天，換液后放入孵箱繼續(xù)培養(yǎng)24h，取出擰緊培養(yǎng)瓶蓋，于37℃恒溫?fù)u床上280r/min搖動(dòng)18h。此時(shí)寡突膠質(zhì)細(xì)胞90％以上在培養(yǎng)懸液內(nèi)而與瓶底貼壁的星形膠質(zhì)細(xì)胞分離。

分離培養(yǎng)懸液內(nèi)的寡突膠質(zhì)細(xì)胞

吸出懸液至離心管內(nèi)950r/min離心10min，棄上清后管內(nèi)加入新鮮GM，吹打成單細(xì)胞懸液，按1.5×105/cm2種入預(yù)先用100μg/L多聚賴氨酸包被好的35mm培養(yǎng)皿培養(yǎng)。24h后換成DF12＋N2的無血清培養(yǎng)液，此后每三天半量換液1次。

瓶底星形膠質(zhì)細(xì)胞的繼續(xù)培養(yǎng)

25cm2培養(yǎng)瓶內(nèi)的星形膠質(zhì)細(xì)胞用D-Hanks液洗2次后常規(guī)傳代，以1.5×105/cm2種入預(yù)先用100μg/L多聚賴氨酸包被好的35mm培養(yǎng)皿培養(yǎng)。培養(yǎng)液為GM，每三天半量換液1次。

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