制取原代CEF

純化病毒第一步

剪碎法CEF的制備

實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備

PH7.2 PBS（SW配）﹑平皿一小包（３個(gè)）﹑飯盒１（器械，玻璃漏斗）﹑飯盒2（紗布）﹑離心管２﹑碘酊﹑廢液缸﹑０.１％新潔爾滅溶液﹑０.２５％胰酶﹑９日齡ＳＰＦ胚２﹑Ｍ１９９培養(yǎng)基

實(shí)驗(yàn)步驟

Ⅰ 首先SPF胚新潔爾滅溶液表面消毒，再碘酊﹑酒精消毒，最后小心敲破氣室

Ⅱ 準(zhǔn)備兩把眼科彎頭鑷子，一把撕破尿囊膜和羊膜，另一把夾雞胚。用鑷子把雞胚取出，浸泡于已倒入PBS的平皿中　①去爪②去內(nèi)臟

Ⅲ 把雞胚從平皿中取出，置于另一含PBS的平皿中，再一次洗滌

Ⅳ 重復(fù)Ⅳ步驟

Ⅴ 把雞胚移至５０ml小燒杯內(nèi)，小剪子剪成肉泥

Ⅵ 把肉泥吸入離心管中，如出現(xiàn)肉塊較大，可繼續(xù)剪，直至全部肉泥吸入離心管中。在離心管中加入PBS,洗３次。上清由紅至清

Ⅶ 加入８ml０.２５％胰酶消化，肉泥由塊狀→絮狀（胰酶pH7，于37℃水浴中預(yù)熱）

Ⅷ 加入Ｍ199培養(yǎng)基終止，注意在加入培養(yǎng)基后輕輕混勻，切勿吹打

Ⅸ 靜置沉淀后，盡量多地棄去上清，加入Ｍ199培養(yǎng)基，吹打，使cell掉落

Ⅹ 拿一cell培養(yǎng)瓶，在過(guò)濾前先用M199潤(rùn)濕紗布，吹打靜置沉淀后吸上清，把上清加入裝有４層紗布的漏斗中過(guò)濾。

Ⅺ 繼續(xù)加Ｍ199培養(yǎng)基吹打，靜置沉淀吸上清過(guò)濾，直至加入的Ｍ１９９培養(yǎng)基吹打后不混濁為止。

Ⅻ 細(xì)胞臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)，細(xì)胞分瓶，每瓶裝７００萬(wàn)細(xì)胞，此方法每胚約能分兩瓶。

剪碎法CEF的制備缺點(diǎn)是獲得的細(xì)胞量較少，優(yōu)點(diǎn)是細(xì)胞活力高。

連續(xù)消化法優(yōu)點(diǎn)是獲得的細(xì)胞量大，缺點(diǎn)是細(xì)胞活力小。

在CEF制取好后，是病毒的侵染和固定細(xì)胞的維持最后是染色。

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