大鼠胰島細胞原代培養

一周齡Wistar大鼠，斷頸處死，于75%乙醇浸泡15分鐘，無菌取出胰臟，于冰冷無菌D-Hanks液中漂洗，用眼科剪仔細清除脂肪、包膜、血管等胰外組織，轉入青霉素小瓶中。

加入少量無菌D-Hanks液，用眼科剪剪成0.1-1.0mm3大小的碎片，用滴管輕輕吸出上層細小脂肪碎塊和油滴，再用無菌D-Hanks液反復清洗8~10次，加入10倍體積無菌消化酶液[胰蛋白酶-膠原酶消化液：0.05g胰蛋白酶(Sigma)，0.025g Ⅴ型膠原酶(Sigma，663U/mg)，0.05g葡萄糖。

溶于100 mL無Ca2+、Mg2+的0.01mol/LPBS（pH值為7.4）溶液，用0.22μm微孔濾膜濾菌]，38℃±1℃消化，消化過程中不斷震蕩，10分鐘后吸出上面酶液棄去，用無菌D-Hanks液將組織塊清洗2~3次，加入新鮮酶液繼續消化，重復上述步驟。

此時組織塊邊緣模糊，再將組織塊浸入消化酶液中，38℃±1℃消化10分鐘，將消化酶液與組織塊分開，組織塊重新加入新鮮消化酶液進行消化；而原消化酶液1500rpm離心10分鐘，取沉淀即為消化下的細胞，重新用無菌D-Hanks懸浮，離心，重復1~2次，再用培養基洗2~3次，用培養基懸浮即得細胞懸液；將消化過的組織塊重復消化5~6次至組織塊消化完全，重復以上操作，合并幾次所得細胞懸液，計數。

調整細胞濃度為2×105個細胞/mL，將細胞懸液接種于24孔塑料培養板中，每孔1mL，置于37℃，5%CO2，飽和濕度培養箱中培養。由于成纖維細胞貼壁要比胰島細胞迅速，接種15小時后，輕輕振蕩培養板，將上面未貼壁的細胞接入新的培養板中，可除去部分成纖維細胞。

將新培養板中細胞培養48小時后，換新鮮配置的含有2.5ng/mL的碘乙酸的培養基培養5小時，可除去絕大部分成纖維細胞，而胰島細胞不受傷害，換不含碘乙酸的培養基洗2次，并換不含碘乙酸的培養基在37℃，5%CO2，飽和濕度培養箱中培養，每隔3天換培養液，獲得單層胰島細胞。

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