視神經少突膠質細胞體外培養純化及鑒定
1.材料和方法
1.1 DMEM/F12條件培養液(亞硒酸鈉40μg·L-1,腐胺16.2 mg·L-1,轉鐵蛋白100 mg·L-1,胰島素234U·L-1,甲狀腺素0.4μg·L-1,黃體酮0.62 mg·L-1,谷氨酰胺3g·L-1)。DMEM/F12培養基、小牛血清購自Hyclone公司,兔抗鼠GC抗體、亞硒酸鈉、腐胺等購自Sigma公司。
1.2 視神經膠質細胞的來源、培養 取新生2d的Wistar大鼠10只(第三軍醫大學大坪醫院野戰外科研究所動物中心提供),無菌條件下取出雙側視神經。接種至24孔培養板內經多聚賴氨酸處理的蓋玻片上。
而后加入含30g·L-1小牛血清的DMEM/F12培養基,37(C,50mL·L-1 CO2,100%濕度連續培養3d。3d后棄廢液,改為含5g·L-1小牛血清DMEM/F12條件培養液繼續培養。每周換液2次。在獲得足夠的細胞數量后,改用無血清條件培養液繼續培養,每2d換液一次。
1.3 形態學觀察 每天在倒置顯微鏡(日本Olympus),觀察培養細胞的生長過程和形態學變化并拍照。
1.4 免疫細胞化學鑒定:將含細胞蓋玻片取出,0.01mol·L-1 PBS沖洗3次×5min;冷丙酮固定10 min;PBS沖洗(3次×5min);30g·L-1過氧化氫室溫孵育15min;PBS沖洗3次×5min;
滴加正常山羊血清,室溫孵育20 min;滴加1:100 GC抗體,陰性對照以PBS代替一抗,37(C孵育60min;PBS沖洗3次×5min;滴加生物素標記羊抗兔IgG,37(C,20min;PBS沖洗3次×5min;滴加辣根酶標記鏈酶卵白素工作液;DAB工作液(武漢博士德公司)顯色,自來水終止反應;脫水,透明,D·P·X封片保存。
2.結果
2.1 形態學觀察結果
組織塊24h開始貼壁,48~72h可見神經組織邊緣游出少量細胞,主要為圓形或梭形。8~9d左右,細胞基本鋪滿培養孔。此時改用無血清條件培養基培養進行純化。培養過程中,部分細胞死亡。12d左右獲得的細胞胞體基本為呈圓形或多角型,直徑約6~10μm。細胞核較大,胞質少。
2.2 免疫組織化學染色結果
培養的視神經少突膠質細胞的免疫組織化學染色GC蛋白陽性,未加一抗的呈陰性。染色結果顯示成熟的少突膠質細胞突起豐富,互相形成蜘蛛網狀。蘇木素復染,異質細胞較少,90%以上為陽性細胞。
3.討論
抑制神經再生基因Nogo的發現為視神經損傷的修復、視功能保護研究帶來了希望。視神經膠質細胞包括星形膠質細胞和少突膠質細胞2種類型,分化不同,功能各異。成熟的少突膠質細胞不再具有分裂增殖能力,為分裂終期細胞,培養較為困難。
1980年McCarthy等建立了從腦灰質組織分離、純化星形膠質細胞和少突膠質細胞的分離培養模型。
目前國內外多采用該法。利用少突膠質細胞和星形膠質細胞貼壁能力的不同采用振動分離法進行分離、培養。此法主要用來獲取星形膠質細胞,獲得的少突膠質細胞較少。存在著操作步驟多容易被污染、分離過程中因振蕩離心易造成機械性損傷導致細胞死亡等缺點。
本實驗采用視神經組織塊培養的方法,對新生大鼠的視神經膠質細胞進行條件化原代培養,利用少突膠質細胞和星形膠質細胞生長條件的不同,采用條件培養基純化2種細胞。
少突膠質細胞和Ⅱ型星形膠質細胞是從一種普通雙潛能的少突膠質細胞-2型星形膠質細胞祖細胞(oligodendrocyte-type-2astrocyte progenitor cell,O2A)發育而來。大鼠出生后約1周,少突膠質細胞逐漸成熟。
因此,從新生大鼠取材可獲得O2A祖細胞。體外研究發現甲狀腺素、胰島素、轉鐵蛋白、腐胺、黃體酮和微量元素硒等,可使O2A祖細胞朝少突膠質細胞定向分化。而血清等可以誘導O2A祖細胞分化為Ⅱ型星形膠質細胞。
我們利用這一特點,逐步減少條件培養基中的血清濃度,促進O2A祖細胞向少突膠質細胞分化。最終采用無血清條件培養基,抑制星形膠質細胞及其它異質細胞增殖,而少突膠質細胞在此條件下則基本不受影響。
GC是表達于少突膠質細胞膜以及髓鞘的一種主要類脂,它是識別少突膠質細胞普遍應用的特異性化學標志物。免疫染色鑒定結果表明純度較高超過90%。此方法簡便、可靠、易于推廣,便于對少突膠質細胞相關課題進行研究。
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