大鼠心室肌微血管內皮細胞的原代培養

材料和方法

1、儀器：

手術器械一套，倒置顯微鏡（Leica）,CO2細胞孵育箱（Heraeus），超凈工作臺（蘇州凈化設備有限公司），掃描電子顯微鏡（Hitachi）。

2、主要試劑:

DMEM高糖培養基（Gibco），胎牛血清（Hyclone，杭州四季青生物工程材料公司），胰蛋白酶、EDTA（Ameresco）；小鼠抗人CD105單克隆抗體（NeoMarkers），兔抗人CD34、CD31多克隆抗體（Antibody Diagnostica Inc），兔抗人vW因子多克隆抗體（華美公司），抗兔及抗鼠ABC試劑盒、DAB顯色試劑盒為華美公司產品，其他試劑均為國產分析純以上級別。

3、方法:

植塊法原代細胞培養：

細胞培養瓶的處理：選用50ml玻璃培養瓶，高壓蒸汽滅菌，瓶底鋪自制鼠尾膠（制作方法參見2），移入80℃烤箱烤干，臨用前用消毒D-Hanks平衡鹽緩沖液沖洗3次。

選用80克SD大鼠（雌雄不限，購自復旦大學實驗動物部），1%戊巴比妥鈉（1ml/100g）腹腔注射麻醉，75%酒精浸泡5min消毒，將大鼠移至超凈臺進行操作，止血鉗固定四肢，逐層打開胸腔，暴露心臟，剪開心包，由升主動脈處剪下心臟，放入D-Hanks平衡鹽緩沖液中.

沖凈心腔中的血液，辨清心臟解剖結構，去除大血管、左右心房以及右心室和室間隔，保留左心室，小心去除心內膜及心外膜，用眼科剪剪碎余下的心室肌約2mm見方，滴加1ml進口胎牛血清.

均勻接種于處理過的50ml培養瓶中，放入37℃、5%CO2、飽和濕度的細胞孵育箱靜置培養，使其貼壁，4小時后追加20%胎牛血清的DMEM高糖培養液4.5ml/瓶，約48小時后組織塊周圍有星形細胞長出.

80至96小時組織塊周圍有大量細胞長出，去除組織塊，繼續培養36-48小時，待細胞匯合鋪滿瓶底后用含0.125%胰蛋白酶、0.02%EDTA的消化液消化細胞進行傳代，取用第二代細胞進行進一步鑒定和實驗。

北京天優福康生物科技有限公司

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