豬甲狀腺細胞原代培養方法

1、材料

豬甲狀腺由錦州市屠宰場提供。F-12培養基（sigma公司）；胎牛血清（天津血液研究所）；胰蛋白酶（sigma公司）；膠原酶Ⅳ（sigma公司）；牛TSH（sigma公司）

2、方法

殺豬后迅速取出甲狀腺1～2個，置于盛有75％酒精的燒杯中，用冰盒送至實驗室（1小時以內）。立即置于pH為7.4的PBS緩沖液（含青鏈霉素）中，反復漂洗，直至漂洗液清澈透明。去除包膜及結締組織，用眼科剪子、鑷子將甲狀腺組織剪成１mm3大小的碎塊。

置含0.25％胰酶和300U/ml膠原酶的容器中，放于37℃溫箱中消化60min，每隔15min需搖動一次。用吸管將上清液的三分之二吸入離心管中，并加入含有胎牛血清的培養基終止消化。以1000轉／分鐘離心10分鐘后，棄上清。

將細胞沉淀用F-12培養基制成細胞懸液，充分吹打并用不銹鋼網（200目）過目，再1000轉／分離心10分鐘，棄上清。沉淀懸于含15％胎牛血清和１U/L牛TSH的F-12培養基中，臺盼藍染色證明活細胞數大于95％，調整細胞濃度接種于培養板中（１ml／孔）。置于37℃的5％CO2孵箱中，每二至三天換一次液，至細胞融合成片后用于實驗。

3、結果

豬甲狀腺細胞培養24小時，鏡下細胞貼壁，呈聚集生長，細胞呈圓形或橢圓形。

4、討論

胰蛋白酶適于消化細胞間質較少的軟組織如上皮組織、肝、腎等，對傳代細胞也非常好。但消化纖維性組織或較硬的癌組織則效果較差。膠原酶對膠原有很強的消化作用，適于消化纖維性組織、上皮組織以及癌組織等。

由于甲狀腺富含纖維性組織，所以甲狀腺的消化分離一般采用膠原酶與胰蛋白酶聯合消化法，用單一的胰蛋白酶消化效果一般；促甲狀腺激素（TSH）是培養甲狀腺細胞必備的，它能夠起到促進甲狀腺細胞生長的作用。本人也曾嘗試過不加TSH，與加TSH對比明顯可見細胞增長較慢，且形態不好。

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