正常動物肺肥大細胞的培養

實驗材料：

1. 正常動物的肺組織；

2. 不含Ca2+ 和Mg2+ 的1×PBS，添加200000IU/L青霉素、200mg/L鏈霉素，pH7.2；

3. TE液：Tyrode液加入2 mmol/L EDTA。Tyrode液含137 mmol/L NaCl、2.7 mmol/L KCl、0.36 mmol/L NaH2PO4 、5.55 mmol/L 葡萄糖；

4. TEA液：TE液加入200mg/L氨芐青霉素、200mg/L慶大霉素和40mg/L甲硝唑；

5. TGMD液：Tyrode液加入0.1%明膠、1.23 mmol/L MgCl2 和15mg/L DNA酶；

6. HA液：HEPES液補充0.25g/L不含脂肪酸的BSA。HEPES液含20 mmol/L HEPES、125 mmol/L NaCl、5 mmol/L KCl和0.5 mmol/L 葡萄糖；

7. HACM液HA液補充1 mmol/L CaCl2 和1 mmol/L MgCl2 ；

8. 消化液a：用TE液配成，含有3g/L鏈霉蛋白酶和0.75g/L木瓜凝乳蛋白酶；

9. 消化液b：用TGMD液配成，含有1.5g/L膠原酶和0.15g/L彈性蛋白酶；

10. Percoll溶液：配成密度為1.090 g/ml、1.080 g/ml、1.070 g/ml和1.062 g/ml的4種溶液；

11. 培養液：ROMI1640，添加10%FBS、50μg/L SCF、2 mmol/L 谷氨酰胺、0.1 mmol/L 非必需氨基酸、100000 IU/L青霉素和100mg/L慶大霉素。pH7.2；

12. 手術刀、解剖剪、解剖鑷、眼科剪，眼科鑷，止血鉗，無菌消毒手術器械；

13. 離心管（15ml、50ml）

14. 網篩：300μm不銹鋼網篩

實驗方法：

1. 取肺組織10—40g，放入4℃的TEA液中，剝除支氣管和血管后，將肺組織切成0.2—1g的小塊，用TEA液沖洗2次；

2. 將肺組織剪碎，加入消化液a，在室溫條件下消化20min。用孔徑為300μm不銹鋼篩網濾去已脫落下來的細胞。用TE液清洗組織塊，加入消化液a，將組織塊重復消化和過濾1次；

3. 用TGMD液清洗組織塊后，加入消化液b，在30℃條件下消化20min。用孔徑為300μm不銹鋼篩網濾出組織塊，收集濾液，在4℃條件下離心（400g，10min）。吸去上清液，用HA液混懸沉淀細胞，在4℃條件下保存；

4. 按操作步驟3重新操作1次，得到細胞懸液；

5. 將操作步驟3和4收集的細胞懸液混合，用孔徑為100μm不銹鋼篩網過濾，收集濾液，在4℃條件下離心（400g，10min）。然后，用4℃的HA液混懸沉淀細胞，再離心1次；

6. 用HACM液混懸細胞，調整細胞密度至0.5×106 —2×106 個/ml；

7. 在離心管中依次緩慢滴入密度為1.090 g/ml、1.080 g/ml、1.070 g/ml和1.062 g/ml的Percoll溶液。在1.062 g/ml的Percoll溶液中預先混入約1×107 個細胞。然后，在20℃條件下離心（500g，40min）；

8. 在密度1.070與1.080、1.080與1.090兩個Percoll溶液界面處收集細胞，用HA液混懸細胞，在4℃條件下離心（400g，10min）。然后，重復離心1次。

9. 用培養液混懸沉淀細胞，調整細胞密度至0.5×106 —2×106 個/ml，放37℃、5%CO2的培養箱中培養。24h后換液，以后每周換液1次；

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