腫瘤細胞培養(yǎng)成纖維細胞排除法

1．機械刮除法：

是用不銹鋼絲末端插有橡膠刮頭（用膠塞剪成三角形插以不銹鋼絲）、或裹少許脫脂棉制成，裝入試管中高壓滅菌后備用（也可用特制電熱燒灼器刮除）。刮除程序為：

（1）標(biāo)記：鏡下觀察，用不脫色筆在培養(yǎng)瓶皿的背面圈下生長腫瘤細胞的部位；

（2）刮除：棄掉培養(yǎng)液，把無菌膠刮伸入瓶皿中，肉眼或顯微鏡窺視下，刮除無標(biāo)記空間；

（3）用Hanks液沖洗一兩次，洗除被刮掉的細胞；

（4）注入培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，如發(fā)現(xiàn)仍有成纖維細胞殘留，可重復(fù)刮除至完全除掉為止

2．反復(fù)貼壁法：

根據(jù)腫瘤細胞比成纖維細胞貼壁速度慢的特點，并結(jié)合使用不加血清的營養(yǎng)液，把含有兩類細胞的細胞懸液反復(fù)貼壁，使兩類細胞相互分離，操作方法與傳代相同。

（1）待細胞生長達一定數(shù)量后，倒出舊培養(yǎng)液，用胰酶消化后，Hanks 沖洗2次，加入不含血清的培養(yǎng)液，吹打制成細胞懸液；

（2）取編號為此A、B、C三個培養(yǎng)瓶；首先把懸液接種入A培養(yǎng)瓶中。置溫箱中靜止培養(yǎng)5～20分鐘后，輕輕傾斜培養(yǎng)瓶，讓液體集中瓶角后慢慢吸出全部培養(yǎng)液，再接種入B培養(yǎng)瓶中后；向A瓶中補充少許完全培養(yǎng)液置溫箱中繼續(xù)培養(yǎng)；

（4）培養(yǎng)B瓶中細胞5～20分鐘后，接處理A的方法，把培養(yǎng)液注入C培養(yǎng)瓶中；再向B瓶中補加完全培養(yǎng)基。

當(dāng)三個瓶內(nèi)都含有培養(yǎng)液后，均在溫箱中繼續(xù)培養(yǎng)。如操作成功，次日觀察可見A瓶主要為成纖維細胞，B瓶兩類細胞相雜，C瓶可能主要為癌細胞。必要時可反復(fù)處理多次，直至癌細胞純化為止。

3．消化排除法：

此法曾用于乳癌細胞的培養(yǎng)，具體程序是：

（1）先是用0.5%胰蛋白酶和0.02％EDTA（1：1）混合液漂洗培養(yǎng)細胞一次，然后再換成新的混合液繼續(xù)消化，并在倒置顯微鏡下窺視和不時搖動培養(yǎng)瓶，到半數(shù)細胞脫落下來后，便立即停止消化；

（2）把消化液吸入離心管中，離心去上清，吸入另瓶中，加培養(yǎng)液置溫箱中培養(yǎng)；向原瓶內(nèi)也補加新的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。用此法處理后，成纖維細胞比腫瘤細胞易先脫落。經(jīng)過幾次反復(fù)處理，可能把成纖維細胞除凈。

4．膠原酶消化法：

本法是利用成纖維細胞對膠原酶較為敏感的特點，通過消化進行選擇。

（1）可用0.5mg/ml的膠原酶消化處理，邊消化邊在倒置顯微鏡下窺視，當(dāng)發(fā)現(xiàn)成纖維細胞被除掉后，即終止消化；

（2）用Hanks洗滌處理一次后，更換新培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)，可獲純凈腫瘤細胞。如成纖維細胞未被除凈，可再次重復(fù)。

5．其它方法：

有人發(fā)現(xiàn)聚丙烯酰胺有抑制成纖維細胞生長的作用；也有人用聚蔗糖制備成比重1.025～1.085的密度梯度離心液，加入細胞懸液后，在23℃中800g離心 10分種。在比重1.025～1.050層為成纖維細胞，在比重1.050～1.085層為上皮細胞，再經(jīng)過分離進行培養(yǎng)。最近也有人應(yīng)用特殊化學(xué)物如SOD抑制成纖維細胞生長的方法。

選用上述任何一種方法，都需進行試驗，取得必要經(jīng)驗，找出適合的條件，才能獲得好的效果。

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