PriCells: 正常人甲狀腺細胞的原代培養方法

實驗材料：

1.甲狀腺細胞材料來源：人孤立性良性甲狀腺腺瘤旁邊正常組織、甲狀腺功能亢進甲狀腺組織或甲狀腺腫瘤組織均可作為研究的材料；

2.不含Ca2+和Mg2+的1×PBS，添加200000IU/L青霉素、200mg/L鏈霉素，pH7.2；

3.培養用液：DMEM培養液，含15%—20%小牛血清、0.6mmol/L的HEPES、12.5mmol/L的谷氨酰胺、100IU/ml青霉素、100μg/ml鏈霉素。用5.6%的NaHCO3溶液調節pH值至7.0左右；

4.消化液：0.25%胰蛋白酶溶液；

5.培養器具：培養瓶或皿、孔徑為100μm的不銹鋼網篩、眼科剪、鑷子等；

培養方法：

1．將所取材料放入加有PBS的無菌容器中，立即送至培養室，時間不超過30min。若不能立即培養，可放在培養液站，置4℃下保存，但時間不炒股4h為宜；

2．在無菌條件下，將組織移至平皿內，用PBS洗滌2—3次。用眼科鑷剝離去除被膜及結締組織，并擠壓出其中的血液成分；

3．用眼科剪將組織剪成1mm3大小的勻漿狀，移入瓶內。加入比細胞多5—10倍量的消化液，于37℃水浴條件下消化30—60min。每隔5—10min搖動1次；

4．消化完畢，加入冷的PBS終止消化。通過孔徑100μm的不銹鋼網篩過濾。收集濾液于離心管中，以1500r/min離心10min。吸去上清液，將細胞沉淀再用PBS漂洗2次。離心棄上清液。收集未通過篩網的組織，加消化液置37℃水浴條件下繼續消化15—30min，并過篩合并。在漂洗后的細胞沉淀中加入一定量的培養液，用吸管吹打數次，制成細胞懸液；

5．吸取少量細胞懸液，加入臺盼藍染液，在血細胞計數板上計數。活細胞比例應大于90%。用培養液稀釋細胞至密度為5×105—10×105個/ml；

6．接種細胞懸液到培養瓶或培養皿中。于37℃、含5%CO2培養箱中培養；

7．次日，吸出培養液以去掉未貼壁的細胞，加入新鮮培養液，以后每隔3—5天換液1次；

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