正常兔原代晶狀體上皮細(xì)胞培養(yǎng)方案
實(shí)驗(yàn)材料：
1. 正常兔晶狀體組織；
2. 不含Ca 2+ 和Mg 2+ 的1×PBS，添加200000IU/L青霉素、200mg/L鏈霉素，pH7.2；
3. 注射器；
4. 培養(yǎng)器具：培養(yǎng)瓶或皿（ 用多聚賴氨酸包被）、眼科剪、鑷子等；
培養(yǎng)方法：
1. 空氣注射處死大兔，在無(wú)菌條件下清除鞏膜外肌肉及結(jié)締組織后將眼球浸入含雙抗的1×PBS（pH7. 2 ）浸泡5min ，移入超凈工作臺(tái)內(nèi)；
2. 用含雙抗的1×PBS（pH7. 2 ）沖洗 組織3遍，在超凈臺(tái)中環(huán)形剪除角膜放射狀剪開(kāi)并撕除虹膜，充分暴露晶狀體赤道部，用眼科鑷盡量靠近赤道部撕下晶體前囊膜，將前囊膜剪成1× 1 mm2 大小的碎片 ；
3. 取200μl的吸頭一只，在酒精燈上用火焰燒彎。用槍頭吸取組織塊接種于培養(yǎng)瓶中，每瓶20 - 25塊左右，每小塊間距0.5cm左右 ；
4. 組織塊放置好后，輕輕將培養(yǎng)瓶翻轉(zhuǎn)，讓瓶底朝上，向瓶?jī)?nèi)加入2ml左右的培養(yǎng)液，蓋好瓶蓋，將培養(yǎng)瓶倒置在培養(yǎng)箱中，干貼壁2-4h ；
5. 干貼壁完成后，將培養(yǎng)瓶慢慢翻轉(zhuǎn)平放，繼續(xù)靜置培養(yǎng)；48h后換液，更換2-3ml即可 ；
6. 貼塊貼壁培養(yǎng)4-7d后，在鏡下觀察可見(jiàn)大量細(xì)胞爬出，用吸管將組織塊吹下、去除，繼續(xù)放置于37℃，5% CO2 培養(yǎng)箱中 ；
注意事項(xiàng) ：
1. 材料預(yù)處理時(shí)要注意小心，不要破壞晶狀體結(jié)構(gòu)，要注意晶狀體前后，確保撕取的是前囊膜。
2. 將組織塊貼于培養(yǎng)瓶中后，對(duì)于培養(yǎng)瓶的移動(dòng)，翻轉(zhuǎn)，加液等動(dòng)作一定要輕柔，以免使組織塊浮起。
3. 去除組織塊的時(shí)機(jī)要選擇好，去除過(guò)早，細(xì)胞數(shù)量太少，會(huì)使細(xì)胞生長(zhǎng)速度變慢，去除時(shí)間太晚，會(huì)使部分區(qū)域細(xì)胞生長(zhǎng)過(guò)密，導(dǎo)致細(xì)胞老化，影響細(xì)胞狀態(tài)。
4. 嚴(yán)格控制上皮細(xì)胞培養(yǎng)條件。包括細(xì)胞培養(yǎng)用液（培養(yǎng)基，生長(zhǎng)因子，血清，抗生素）的質(zhì)量，濃度。
5. 關(guān)于培養(yǎng)瓶包被與否，有文獻(xiàn)研究顯示包被與未包被之間沒(méi)有特別大的差異。 實(shí)驗(yàn)中，可以酌情考慮是否包被。
6. 傳代培養(yǎng)細(xì)胞接種量為5×104 個(gè)（25 cm2培養(yǎng)瓶），細(xì)胞倍增時(shí)間為48小時(shí)。細(xì)胞傳代培養(yǎng)最佳為3-5代，5代后晶體上皮細(xì)胞明顯成纖維細(xì)胞化，呈梭形或條狀，細(xì)胞大小不等，細(xì)胞相互分離形成拉網(wǎng)現(xiàn)象，傳代消化時(shí)間會(huì)有所延長(zhǎng)。
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