生長曲線測定（計數法）
實驗目的
1.能獨立的進行細胞技術，會繪制生長曲線，了解細胞生長的發育特性。
2. 學習在科研中如何應用生長曲線。
實驗原理
生長曲線的測定（計數法）是測定細胞絕對生長數的常用方法，也是判定細胞活力的重要指標，為培養細胞生物學特性的基本參數之一。一般細胞傳代之后，經過短暫的懸浮然后貼壁，隨后度過長短不同的潛伏期，即進入大量分裂的指數生長期。在細胞達到飽和密度后，停止生長，進入平頂期，然后退化衰亡。為了準確描述整個過程中的細胞數目的動態變化，需連續對細胞進行計數，通常計數7天。為精確起見，一般每次計數三瓶細胞并取平均值。典型的生長曲線可分為生長緩慢的潛伏期，成平臺狀的平頂期及退化衰亡四個部分。以存活細胞數對培養時間做圖，即生長曲線。
生長曲線常用于測定藥物等外來因素對細胞生長的影響。一般在對數期的1/3-1/2處加藥。細胞技術的時間和次數依實驗目的而定。
另外，測定生長曲線的常用方法還有mtt 法。
實驗步驟
1. 胰酶消化細胞（一般用三種細胞，本實驗用Hep2，Mel，CHO，本實驗組用CHO），用新培養基中止，制成細胞懸液，吹打均勻，計數。
2.根據計數結果，每個方瓶中接細胞3×105個，加3mL培養基。一種細胞接15瓶。用作對照組4瓶，三個藥物梯度（5、10、15ug/mL）各三瓶，2瓶備用。（本實驗組因為細胞有限，故只接了7瓶，對照四瓶，10ug/mL三瓶）
3.24h后，計數1瓶細胞（相當于所有的瓶子的細胞都以這個數計算），分別加藥。
4.48h、72h、96h后，分別計數，每個藥物梯度和對照組各計一瓶。
5.計數是，用胰酶消化稍過一點。用原培養基中止消化。（這樣做可以防止細胞損失）用27uL細胞和3uL臺盼蘭染色計數活細胞。要定容培養基的量（加入胰酶后的體積）第5步不用再超凈臺中完成。
6.以細胞數為縱軸，以時間為橫軸作圖。
實驗結果
我們可以看到，藥物處理組明顯不如對照組生長狀況好，在第三天和第四天都不如對照組的細胞數量，實驗組對數期曲線的斜率不如對照組。這說明該藥物對細胞的增殖有一定抑制作用。
在對照組和實驗組的兩條曲線我們都可以看出，細胞在方瓶中的生長第一天都沒有達到原來的3×105個，這說明有些細胞死亡，而存活的細胞因為貼壁、適應新環境，有一個潛伏期，所以第一天細胞數量有一定的減少。之后細胞生長進入對數期，我們看到在兩種環境中的細胞都表現出了對數期的大量增殖。如果試驗持續，我們還會看到平臺期和衰亡期，但由于時間所限，我們只看到對數期。
實驗分析
生長曲線是一個很重要的實驗，在很多文獻中均有提到。它可以幫助我們篩選藥物，確定藥物的活性，制定合理的后續實驗方案以及了解細胞的生長能力。被處理過的細胞，還可以用于細胞形態特征（如Ho.33342染色觀察凋亡小體）、生化特征（DNA、RNA提取 ，DNA ladder）以及細胞時相（流式細胞術觀察細胞時相）等方面。實際上，我們的流式細胞術的實驗就是用我們組自己處理的CHO細胞來完成的。生長曲線的測定方法還有MTT法，它是測定細胞琥珀酸脫氫酶的活性，然后用OD值來確定細胞的數量。
通常，生長曲線的實驗要至少包括3種細胞，最好除了腫瘤細胞還要有正常細胞。（本實驗用Hep2，Mel，CHO）為了準確描述整個過程中的細胞數目的動態變化，需連續對細胞進行計數，通常計數7天。為精確起見，一般每次計數三瓶細胞并取平均值。但是因為實驗條件所限，所以我們的實驗沒有進行得那么完整。在以后自己真正的工作中，我們必須嚴格按照慣例來做。在選擇細胞做生長曲線實驗時，我們必須選取對數期的1/3-1/2的細胞，這是的細胞最有活力，對藥物的反應也最敏感。事實上，大多數細胞學的實驗都是用對數期的1/3-1/2的細胞。
要做好生長曲線（計數法）的實驗，我們必須注意以下的要點。首先，要保證每一瓶中細胞的數量是一致的。這要求在我們接細胞時就必須準確，否則實驗會有很大誤差。其次，每天計數時，要將細胞完全從瓶壁上洗下。所以，在我們用胰酶消化時，可以稍微過頭。取走細胞后，我們還可以用顯微鏡鏡檢方瓶。再次，細胞計數時要共計數2塊計數板，即4個格子，以減少誤差。事實上，我們發現兩塊計數板之間還是有很大誤差的。計數時，每一個中格的細胞數最好在10-50之間，我們的實驗組最高達到了70左右，這實際上對計數結果帶來了一定的誤差，應該將細胞適當稀釋。最后，我們用臺盼蘭染色時間不可以過長。否側或細胞會被臺盼蘭殺死，使得細胞膜 通透性喪失，也被染上色，這使得計數結果偏低。
實驗數據最好經過統計的處理，這樣更具有說服力，如進行相關性的檢驗。（可以使用SPSS軟件）
計數法和MTT法的區別是計數法確定的是細胞的絕對數量，而MTT法實際上是檢測細胞的代謝強度，當然，這與細胞的數量也是有一定的正比關系的。如果用MTT法，必須首先測出OD值與細胞數量的趨勢線，在相關線性范圍內，用MTT法測細胞數量。在需要知道確切數量時還使計數法更為準確、可靠。
