細(xì)胞計(jì)數(shù)及活力測定方法

一、原理

培養(yǎng)的細(xì)胞在一般條件下要求有一定的密度才能生長良好，所以要進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。計(jì)數(shù)結(jié)果以每毫升細(xì)胞數(shù)表示。細(xì)胞計(jì)數(shù)的原理和方法與血

細(xì)胞計(jì)數(shù)相同。

計(jì)算細(xì)胞數(shù)目可用血球計(jì)數(shù)盤或是Coulter counter 粒子計(jì)數(shù)器自動(dòng)計(jì)數(shù)。 血球計(jì)數(shù)盤一般有二個(gè)chambers，每個(gè)chamber 中細(xì)刻9 個(gè)1 mm正方形再細(xì)刻16 個(gè)小格，深度均為0.1 mm。當(dāng)chamber 上方蓋上蓋玻片后，每個(gè)大正方形之體積為1 mm2 x 0.1 mm=1.0 x 10-4 ml。使用時(shí)，計(jì)數(shù)每個(gè)大正方形內(nèi)之細(xì)胞數(shù)目，乘以稀釋倍數(shù)，再乘以104，即為每ml 中之細(xì)胞數(shù)目。在細(xì)胞群體中總有一些因各種原因而死亡的細(xì)胞，總細(xì)胞中活細(xì)胞所占的百分比叫做細(xì)胞活力，由組織中分離細(xì)胞一般也要檢查活力，以了解分離的過程對細(xì)胞是否有損傷作用。復(fù)蘇后的細(xì)胞也要檢查活力，了解凍存和復(fù)蘇的效果。存活測試之步驟為dye exclusion，利用染料會(huì)滲入死細(xì)胞中而呈色，而活細(xì)胞因細(xì)胞膜完整，染料無法滲入而不會(huì)呈色。一般使用藍(lán)色之trypan blue 染料，如果細(xì)胞不易吸收trypan blue，則用紅色之Erythrosin bluish 。利用細(xì)胞內(nèi)某些酶與特定的試劑發(fā)生顯色反應(yīng)，也可測定細(xì)胞相對數(shù)和相對活力。

二、儀器、用品與試劑

0.4 % w/v 臺盼蘭trypan blue (GibcoBRL 15250-061)

Erythosin bluish stain

取0.1 gram Erythrosin bluish (Sigma E-9259) 及0.05 gram preservative methyl paraben (Sigma H-3647) 溶于100 ml Ca++/Mg++ free saline血球計(jì)數(shù)盤及蓋玻片(Hem℃ytometer and coverslip)計(jì)數(shù)器(counter)低倍倒立顯微鏡

粒子計(jì)數(shù)器(Coulter counter, Coulter Electronics)

三、操作步驟

（一）細(xì)胞計(jì)數(shù)

3.1. 取50ml 細(xì)胞懸浮液與50ml trypan blue (or Erythrosin bluish) 等體積混合均勻于1.5ml 小離心管中。

3.2. 取少許混合液(約15ml) 自血球計(jì)數(shù)盤chamber 上方凹槽加入，蓋上蓋玻片，于100 倍倒立顯微鏡下觀察，活細(xì)胞不染色，死細(xì)胞則為藍(lán)色 ( 或紅色- Erythrosin bluish) 。

3.3. 計(jì)數(shù)四個(gè)大方格之細(xì)胞總數(shù)，再除4，乘以稀釋倍數(shù)(至少乘以2，因與trypan blue等體積混合)，最后乘以104 ，即為每ml 中細(xì)胞懸浮液之細(xì)胞數(shù)。若細(xì)胞位于線 上，只計(jì)上線與右線之細(xì)胞(或計(jì)下線與左線之細(xì)胞)。

3.4. 若不用血球計(jì)數(shù)盤，可用Coulter counter 作自動(dòng)計(jì)數(shù)，惟無法辨別死細(xì)胞或活細(xì) 胞。

然后按下式計(jì)算：

細(xì)胞數(shù)/ml＝4大格細(xì)胞總數(shù)x 2/ 4×10000

注意：鏡下偶見由兩個(gè)以上細(xì)胞組成的細(xì)胞團(tuán)，應(yīng)按單個(gè)細(xì)胞計(jì)算，若細(xì)胞團(tuán)占 10%以上，說明分散不好，需重新制備細(xì)胞懸液。

（二）細(xì)胞活力

1、將細(xì)胞懸液以 0.5ml加入試管中。

2、加入 0.5ml 0.4%臺盼蘭染液，染色 2一 3分鐘。

3、吸取少許懸液涂于載玻片上，加上蓋片。

4、鏡下取幾個(gè)任意視野分別計(jì)死細(xì)胞和活細(xì)胞數(shù)，計(jì)細(xì)胞活力。

死細(xì)胞能被臺盼蘭染上色，鏡下可見深蘭色的細(xì)胞，活細(xì)胞不被染色，鏡下呈無色透明狀。

活力測定可以和細(xì)胞計(jì)數(shù)合起來進(jìn)行，但要考慮到染液對原細(xì)胞懸液的加倍稀釋作用 。

范例：

T75 monolayer culture 制成10ml 細(xì)胞懸浮液，取0.1 ml 溶液與0.1ml trypan blue 混合均勻于試管中，取少許混合液加入血球計(jì)數(shù)盤，計(jì)數(shù)四大方格內(nèi)之

細(xì)胞數(shù)目。

活細(xì)胞數(shù)/方格：55 ,62, 49, 59

死細(xì)胞數(shù)/方格：5, 3, 4, 6

細(xì)胞總數(shù)= 243

平均細(xì)胞數(shù)/方格= 60.75

稀釋倍數(shù)= 2

細(xì)胞數(shù)/ml：60.75 x 104 x 2 = 1.22 x 106

細(xì)胞數(shù) /flask： 1.22 x 106 x 10ml = 12.2 x 106

存活率：225/243﹦92.6 %

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（三）MTT法測細(xì)胞相對數(shù)和相對活力

活細(xì)胞中的琥珀酸脫氫酶可使 MTT分解產(chǎn)生蘭色結(jié)晶狀甲贊顆粒積于細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞周圍。其量與細(xì)胞數(shù)呈正比，也與細(xì)胞活力呈正比。

l、細(xì)胞懸液以 1000rpm離心 10分鐘，棄上清液。

2、沉淀加入 0.5－1ml MTT，吹打成懸液。

3、37℃下保溫 2小時(shí)。

4、加入 4—5 ml酸化異丙醇（定容）。打勻。

5、1000 rpm離心，取上清液酶標(biāo)儀或分光光度計(jì) 570nm比色，酸化異丙醇調(diào)零點(diǎn)。

注意：MTT法只能測定細(xì)胞相對數(shù)和相對活力，不能測定細(xì)胞絕對數(shù)。

附：

1、0.4%臺盼蘭染液配制：

臺盼蘭 0.4克 加雙蒸水至 100 ml。Cbeqe

2、MTT配制：

MTT 0.5克，溶于 100 ml的磷酸緩沖液或無酚紅的基礎(chǔ)液中。4℃下保存。

3、酸化異丙醇配制：

異丙醇中加入 HCl使最終達(dá) 0.04mol/L。