初代細胞培養實驗-消化培養法
原理
合成培養基胰蛋白酶消化培養法，能把組織塊分散成細胞團或單個細胞，便于細胞從培養液中攝取營養和排出代謝產物，細胞能較快地長成單層。
本法尤適用于培養大量組織，細胞產量高；但用于經常性小量培養工作稍顯繁瑣，無菌操作不良時且易污染。
材料與儀器
組織
Hanks 培養液 胰蛋白酶
吸管 平皿 培養瓶 燒杯 攪拌器 三角燒瓶 不銹鋼篩 眼科剪 眼科鑷 計數板
步驟
1. 準備
取各種已消毒的培養用品置于凈化臺面，紫外線消毒20 分鐘；
2. 布局
點燃酒精燈（或煤氣燈），安裝吸管帽（應通過火焰）；
3. 處理組織
把組織塊置入燒杯中，用Hanks液漂洗2~3 次，去除血污；如懷疑組織可能污染，可先置于含有青鏈霉素的混合液中30~60 分鐘；
4. 剪切
用眼科剪把組織塊切成2~3 毫米大小的塊（用手術刀割亦可），以便于消化；加入比組織塊總量多30~50 倍的胰蛋白酶液，然后一并倒入三角燒瓶中，結扎瓶口或塞以膠塞；
5. 消化
或用恒溫水浴，或置入37 ℃溫箱消化均可，消化中每隔20 分鐘應搖動一次，如用電磁恒溫攪拌器消化更好（消化前瓶中需置一無菌攪棒）；消化時間依組織塊的大小和組織的硬度而定；
6. 分離
在消化過程中見消化液發混濁時，可用吸管吸出少許消化液在鏡下觀察，如組織已分散成細胞團或單個細胞，立即終止消化，隨即通過適宜不銹鋼篩，濾掉尚未充分消化開的組織塊（必要時可繼續進行消化）；低速（500~1000 轉/分）離心消化液5 分鐘，吸出上清，加入適量含有血清的培養液（如有其它酶或EDTA 等消化，需用Hanks液洗脫一兩次后，再加入培養液）；
7. 計數
用計數板計數，如細胞懸液細胞密度過大，再補加培養液調整后，分裝入培養瓶中；對大多數細胞來說，pH 要求在7.2~7.4范圍，培養液呈微紅色，如顏色偏黃，說膽液體變酸，可用NaHCO3調整；
8. 培養
置入36.5 ℃溫箱培養；如用CO2溫箱培養，瓶口需用紗布棉塞或螺旋帽（松口）堵塞，紗布塞易生霉菌，每次換液時需更換新塞。
注意事項
組織塊、胰蛋白酶、培養液等易受紫外線傷害的物品，最好在培養時再攜入操作野；如預先置入，需用紙張覆蓋，以免受射線影響；開始工作前先洗手、75%酒精擦拭手至肘部（工作時宜挽上袖口）。
常見問題
最常用的初代培養有組織塊培養和分散細胞培養。組織塊培養是將剪碎的組織塊直接移植在培養瓶壁上，加入培養基后進行培養。分散細胞培養則是將組織塊用機械法或化學法使細胞分散。如欲從胎兒或新生兒的組織分離到活性最好的游離細胞，經典的方法是用蛋白水解酶(如胰蛋白酶和膠原酶)消化細胞間的結合物，或用金屬離子螯合劑(如EDTA)除去細胞互相粘著所依賴的Ca2＋，再經機械輕度振蕩，使之成為單細胞。
參考《組織培養和分子細胞學技術》北京出版社
