脂肪細胞的原代培養

原理

從脂肪組織中分散的細胞用25txm篩網過濾，可以排除成熟脂肪細胞，過濾下來的基質血管(stromal-vascular，SV)細胞在化學限定性無血清培養液中培養，可使前脂肪細胞得到優勢生長，并逐漸積聚脂肪，發育為成熟脂肪細胞。

材料與儀器

雄性 Sprague-Dawley 大鼠
KRBH緩沖液 KRBH-A緩沖液 DMEM-A DMEM-B 膠原蛋白酶
Petri培養皿 錐形離心管 聚丙烯管 低密度聚丙烯瓶 尼龍濾網 尖解剖剪 Perry鑷 塑料箱 鍘刀 移液器

步驟

1. 主要實驗材料

(1)細胞來源：4周齡雄性Wistar或其他品系大鼠。

(2)清洗液：不含Ca2+、Mg2+的PBS，加入100 U/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素。

(3)消化液：2mg/mL膠原酶溶液，DMEM培養液配制，并加入牛血清白蛋白20mg/mL。

(4)培養液A：DMEM培養液，添加10％胎牛血清、100U/mL青霉素、50μg/mL鏈霉素。

(5)培養液B：培養液A，添加33 μmol／L生物素、17μmol／L泛酸鹽(pantothenate)。

(6)培養液C：DMEM／Ham F12(1:1，V/V)混合培養液，加人15mmol／L

NaHCO3、15 mmol／L HEPES、33 μmol／L人生物素、17 μmol／L泛酸鹽、100U／mL青霉素、50 μg／mL鏈霉素，pH 7.4。

(7)ITT培養液：培養液C，添加5 μg／mL胰島素、10 μg／mL轉鐵蛋白、200

pmol／L 三碘甲腺原氨酸(T3)。

(8)篩網：孔徑為25 μm的尼龍篩網。

2. 操作方法

A．取材

(1)4周齡雄性大鼠，乙醚麻醉后斷頭處死。

(2)無菌條件下從附睪周圍切取脂肪墊，放入培養皿中，并盡量除去血管，清洗液沖洗3次。

B．分離細胞 

(1)充分剪碎組織，放人消化液中，37℃水浴振蕩消化40min。

(2)將消化液倒入加有培養液A的燒杯中，用吸管反復吹打，并用孔徑25μm

的尼龍篩網過濾，收集濾液和未濾過的組織塊。

(3)濾液1800r／rain離心5min，棄上清；加入培養液B，制成SV細胞懸液，暫存入4℃冰箱中。

(4)將未濾過的組織塊重復處理一次，離心沉淀的SV細胞團用培養液B制成

SV細胞懸液。

(5)合并兩次獲得的SV細胞懸液，吸管吹打混勻；取少量SV細胞懸液，計數，并調節細胞密度。計數時不計入血細胞。

C．原代培養

(1)以104個/cm2的密度將細胞接種于加有培養液B的培養皿中，于37℃、5％CO2培養箱中培養12～24h。

(2)細胞貼壁后，培養液C清洗2次，后加人培養液C過渡培養1h。

(3)棄培養液C，PBS清洗2次。

(4)ITT培養液維持培養，每3天換液一次。

注意事項

1. 脂肪細胞既可取材于附睪周圍，也可從大鼠腹膜后或腹股溝部皮下取材，若在腹股溝部取材，則需清除乳房組織。

2. ITT培養液是大鼠前脂肪細胞向脂肪細胞轉化的化學限定性無血清培養基，不能促使SV細胞增殖，但培養液B可以。

3. 培養液B(含血清)預培養SV細胞12～24h是為了促使細胞貼壁，若用能促進細胞黏附的生長基質成分(如纖維連接蛋白、層粘連蛋白、膠原等)預先包被培養表面，則可不必預培養，

常見問題

來源《常用醫用細胞培養》