細(xì)胞團(tuán)抽提

原理

用 Qiagen?QIAamp?迷你試劑盒從細(xì)胞團(tuán)提取 DNA；抽提到的 DNA 用SGMPlius?擴(kuò)增，然后用 ABI377 DNA 測(cè)序儀進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，用GeneScan?和Genotyper?軟件進(jìn)行分析。

材料與儀器

Qiagen?DNA迷你試劑盒
無水乙醇 磷酸緩沖液
小離心管 離心機(jī) 水浴或可以維持56℃的烤箱 渦流混合器

步驟

一、開始實(shí)驗(yàn)前，必須準(zhǔn)備以下試劑：

(a)蛋白酶溶劑溶解：向 Qiagen? 冷凍干燥的蛋白酶中加適量蛋白酶溶劑。該溶液 2~8°C 保存 2 個(gè)月內(nèi)穩(wěn)定。

(b)AW 1 和 AW 2 緩沖液：向裝有 AW 1 和 AW 2 濃縮液的瓶子中加人適量無水乙醇。AW 1 和 AW 2 緩沖液室溫下一年內(nèi)穩(wěn)定。

(c)AL 緩沖液：用前顛倒充分混勻。

二、操作步驟
（試劑盒生產(chǎn)商的操作步驟，稍加修改）

如果細(xì)胞不是以培養(yǎng)基懸浮的細(xì)胞懸液，從步驟 5 進(jìn)行。

如果收到的是在培養(yǎng)基中的細(xì)胞團(tuán)：

1. 樣品 20000 g 離心（離心機(jī)，如Eppendorf 5415D 或相似規(guī)格） 3 min 。

2. 用細(xì)尖移液管，小心移棄上清液。

3 . 以 200 μl PBSA 懸浮細(xì)胞。

4. 重復(fù)步驟 1、2 一次。

5. 以 200 μl PBSA 懸浮細(xì)胞。

6. 將 20 μl Qiagen? 蛋白酶加到標(biāo)記好的 1.5 ml 空離心管（如 Eppendorf Biopure Safelock tubes）中。

7. 取 200 μl 各樣品，加到相應(yīng)標(biāo)記的已加蛋白酶的離心管中。

8. 每管中加 200 μl AL 緩沖液（裂解緩沖液）。

9. 樣品在 56°C 孵育 30 min 。

10. 每管用渦流混旋器混勻約 15 s。

11. 之后，1000 g 離心 3 s，使管中內(nèi)容物聚到管底。 .

12. 小心打開每管，加人 200 μl 無水乙醇。

13. 每管用渦流混旋器混勻約 15 s。1000 g 離心 3 s，使管中內(nèi)容物沉淀。

14. 小心將每管的內(nèi)容物轉(zhuǎn)移到對(duì)應(yīng)標(biāo)記的 QIAamp? 旋轉(zhuǎn)柱中，該離心柱已置于收集管中。

15. 抒緊離心柱的蓋子，6000 g 轉(zhuǎn) 1 min 。

16. 將旋轉(zhuǎn)柱置于干凈的收集管中，棄掉含濾液的管子。

17. 小心打開旋轉(zhuǎn)柱的蓋子，加入 500 μl AW1 緩沖液。

18. 重復(fù)步驟 15 和 16。

19. 小心打開旋轉(zhuǎn)柱的蓋子，加入 500 μl AW2 緩沖液。

20. 擰緊蓋子，20000 g 離心 3 min。

21. AW 2 對(duì)下游使用有破壞作用，所以建議更換收集管，旋轉(zhuǎn)柱在以 20000 g 轉(zhuǎn)離心 1 min 。確保所有的 AW 2 緩沖液已棄掉。

22. 將柱子放入對(duì)應(yīng)標(biāo)記的 1.5 ml 離心管中。

23. 打開柱子的蓋，加 200 μl AE 緩沖液（洗脫緩沖液）。

24. 56°C 孵育 1 min，然后 6000 g 再離心 1 min 。

25. 每個(gè)樣品的 DNA 進(jìn)行定量，如用 Picogreen （Molecular Probes）。

26. 如果不是馬上進(jìn)行擴(kuò)增，樣品應(yīng)凍存。