氯霉素乙酰基轉(zhuǎn)移酶（CAT）測(cè)定實(shí)驗(yàn)

原理

氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶報(bào)告基因(chloramphenicol acetyltransferase, CAT)能將乙酰基從乙酰輔酶A轉(zhuǎn)移到氯霉素上。本試劑盒采用熒光測(cè)定的方法，檢測(cè)CAT活性，它的靈敏度接近同位素測(cè)定方法，而操作極為簡(jiǎn)便、快捷，成本也大為降低。使用通用裂解緩沖液，能與其他類型的報(bào)告基因檢測(cè)和蛋白含量檢測(cè)兼容。

材料與儀器

細(xì)胞樣本
Tris-緩沖液 Tris 三硝基甲苯（Triton） CAT 稀釋緩沖液 CAT 酶標(biāo)準(zhǔn)物 閃爍液 聚丙烯閃爍杯
微量離心管 微量離心機(jī)

步驟

一、材料

滅菌物品

1. D-PBSA

2. 多孔培養(yǎng)板：6 孔，35 mm

非消毒物品

1. Tris-緩沖液：Tris-HCl，0.1mol/L，pH8.0

2. Tris/三硝基甲苯（Triton）：Tris-HCl，0.1mol/L，pH8.0，0.1%TritonX-100,4℃ 儲(chǔ)存

3. CAT 稀釋緩沖液：Tris-HCl，0.1mol/L，pH8.0，50% 甘油，0.2%BSA

4. 底物：含 250 mmol/L 氯霉素（GIBCO）的 100% 甲醇；分裝，-70℃ 儲(chǔ)存

5. 14C-CoA：14C-丁酸輔酶 A（10uCi/mL；AmershamPharmacia）

6. CAT 酶標(biāo)準(zhǔn)物：制備含 0.2、1.0、2.0、4.0、10U/mL 標(biāo)準(zhǔn)液的 CAT 稀釋緩沖液，4℃ 儲(chǔ)存

7.「雞尾酒」閃爍液：Econofluor（Invitrogen）

8. 去離子蒸餾水（DDW）

9. 聚丙烯閃爍杯：3.5 mL

10. 微量離心管

11. 微量離心機(jī)

12. 冰浴

方法A：6 孔、35 mm 培養(yǎng)板上的細(xì)胞收集
1. 轉(zhuǎn)染后 24~72 h，用 D-PBSA 液洗滌細(xì)胞。

2. 將培養(yǎng)板置于冰上，每孔中加入 1 mL 的 Tris/Triton。

3. 將培養(yǎng)板-70℃ 冷凍 2 h。

4. 于 37℃ 下解凍培養(yǎng)板，然后將其置于冰上。

5. 將細(xì)胞裂解物移至微量離心管中，以最大速度離心 5 min。

6. 收集上清液，65℃ 加熱 10 min，以滅活 CAT 抑制物質(zhì)。

7. 最大速度離心 3 min 后收集上清液（細(xì)胞裂解物），將上清液保存在-70℃。

方法 B：CAT 測(cè)定

8. 從每一樣品中取 5~150uL 細(xì)胞裂解物，移至一個(gè) 3.5 mL 多聚丙烯閃爍杯中，并且加入足夠的 0.1mol/L Tris，終末體積為 150uL。

9. 設(shè)空白杯，加入 150uL 0.1mol/LTris 液，作為陰性對(duì)照。

10. 陽(yáng)性對(duì)照：
（a）取 5 個(gè)閃爍杯，各加入 150uL 0.1mol/LTris。
（b）將 5uL 的 CAT 標(biāo)準(zhǔn)液加入到每個(gè)閃爍杯中，繪制 1、5、10、20、50mU 的 CAT 標(biāo)準(zhǔn)曲線。

11. 在所有樣品杯（包括對(duì)照）中，加入 100uL 以下混合液：
（a）84uL 超純水
（b）10uL 0.1mol/LTris
（c）1uL 的氯霉素
（d）5uL（50nCi）的 14C-CoA

12. 擰緊杯蓋，于 37℃ 下孵育 2 h。

13. 向所有閃爍杯中加入 3 mL Econofluor，擰緊杯蓋。

14. 上下倒置混勻閃爍杯中成分。

15. 室溫下孵育 2 h。

16. 在一個(gè)液閃計(jì)數(shù)儀上測(cè)定 30s 閃爍次數(shù)。                                                                  

注意事項(xiàng)

1. 在表達(dá)質(zhì)粒擴(kuò)增與制備一步，要特別注意其純度（不能含RNA和染色體DNA）以免影響轉(zhuǎn)化效率

2. 制備方法最好選用溶菌酶加Triton10，然后氯化艷梯度離心。

3. 一定要有對(duì)照組用CAT酶代替細(xì)胞提取液，來(lái)驗(yàn)證反應(yīng)及層析等過(guò)程的可行性，或用Psv:CAT和Psv。cAT表達(dá)質(zhì)粒驗(yàn)證轉(zhuǎn)化及重組兩步的正確性。

4. 在制備細(xì)胞提取液中最好選用超聲波破碎法，離心前要注意檢查破碎程度。凍融法繁瑣有時(shí)破碎不徹底影響結(jié)果。

5. 4mmol/L乙酞輔酶A可每次取1.smg溶在500川水中，最好用前配制，配制的溶液可保存于一20℃，但不可超過(guò)十天。

常見(jiàn)問(wèn)題

成功地組裝表達(dá)質(zhì)粒是該項(xiàng)檢測(cè)技術(shù)的關(guān)鍵之一,表達(dá)DNA質(zhì)粒必須具有下列幾種元件:（1）供細(xì)胞復(fù)制的原核編碼順序和供啼選用的標(biāo)記基因(抗菌素基因);（2）控制真核細(xì)胞轉(zhuǎn)錄的調(diào)控元件(增強(qiáng)子、啟動(dòng)子);（3）控制轉(zhuǎn)錄后的一些信號(hào),轉(zhuǎn)錄加工裁剪信號(hào),加尾信號(hào),供在哺乳動(dòng)物表達(dá)中用;（4）未知待測(cè)基因順序可取代上述的轉(zhuǎn)錄調(diào)控順序;（5）標(biāo)記基因(氯霉素乙酸轉(zhuǎn)移酶)。

參考：
1、《動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)：基礎(chǔ)技術(shù)指南（第五版）》；
2、《霉素乙酞轉(zhuǎn)移酶檢測(cè)(CATassay)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床》