原位染色技術

原理

β-半乳糖苷酶是一種常用的報告基因分子，通過原位染色，在普通的光學顯微鏡下就可以用于檢測到β-半乳糖苷酶的表達。

材料與儀器

β-gal表達質粒轉染細胞
D-PBSA 染色液
6 孔培養板 恒溫箱 倒置顯微鏡

步驟

一、材料
非消毒物品 

1. D-PBSA

2. 底物：X-gal（nvitrogen），以二甲基甲酰胺配成 20 mg/mL，用多聚丙烯管-20℃ 避光保存，最長可達 6 個月 

3. 固定液：1.8% 的甲醛和 0.05% 戊二醛，均以 PBSA 液配制；將 85 mL 水、10 mL 的 10x D-PBSA、5 mL 福爾馬林（37% 甲醛溶液）及 0.2 mL 戊二醛（25% 溶液）混合，制備成固定液，于 4℃ 儲存 

4. 染色液：含 5 mmol/L 鐵氰鉀，5 mmol/L 亞鐵氰鉀，2 mmol/LMgCl2，以 D-PBSA 配制，4℃ 儲存 

5. 底物/染色液：1 mg/mLX-gal，以染色液配制，現用現配 

6. 含 10% 甲醛的 D-PBSA 液 

7. 將β-gal 的表達質粒作為報告基因轉染（如：pcMV β-gal ）

二、操作步驟：
1. 用 2 mL D-PBSA 液洗滌細胞（如在 6 孔培養板上）。

2. 用 1 mL 固定液于室溫下固定細胞 5 min。

3. 用 2 mL D-PBSA 洗滌細胞 2 次。

4. 將 1 mL 底物/染色液加入到每個培養孔內，37℃ 孵育 2 h。

5. 用 2 mL D-PBSA 液沖洗每孔細胞，在倒置顯微鏡下觀察細胞，計數藍染（β-gal 陽性）細胞。

6. 培養板的儲存。在每孔加 1 mL 含 10% 甲醛的緩沖鹽溶液，室溫下固定 10 min，然后用緩沖鹽溶液洗滌細胞，4℃ 儲存緩沖鹽溶液。  

注意事項

1. ?β-Gal?Fixative有一定的腐蝕性和氣味，操作時請注意防護。

2. β-半乳糖苷酶染色反應依賴于特定的pH條件，不能在二氧化碳培養箱中進行染色反應。用于細胞培養的二氧化碳培養箱中較高濃度的二氧化碳會影響染色工作液的pH值，而導致染色失敗。

3. ?配制染色工作液時需使用聚丙烯（polypropylene）容器或玻璃容器，不宜使用聚苯乙烯（polystyrene）容器。但染色時可以在聚苯乙烯（polystyrene）容器中進行，例如普通的6孔板就可以用作染色的容器。

常見問題

1. 一種基于衰老時SA-β-Gal?（senescence-associated?β-galactosidase）活性水平上調而對衰老細胞或組織進行染色檢測。

2. 對于組織切片：（1）?對于石蠟切片先按照常規方法進行脫蠟和水化處理。對于冷凍切片直接按照以下步驟進行。?（2）?加入適當體積的β-半乳糖苷酶染色固定液，以充分蓋住組織為宜，室溫固定不少于15分鐘。（3）用PBS浸泡洗滌組織3次，每次不少于5分鐘。（4）普通光學顯微鏡下觀察。如不能及時觀察，加上封片液封片后4℃可以保存較長時間。

來源《動物細胞培養：基礎技術指南（第五版）》