原代腎上皮細胞培養實驗

原理

將自皮質切除的組織快切成碎塊，沖洗后放入膠原蛋白酶和胰蛋白酶混合液，搖晃消化。定時用吸管研磨組織塊，然后收集分離的細胞。用一定孔徑大小的濾網過濾細胞懸液，除去未消化的組織塊。然后，洗細胞，清除消化酶。用添加血清的培養液混懸細胞，將細胞接種于塑料培養器皿。

材料與儀器

腎組織片
DMEM FBS 膠原蛋白酶 胰蛋白酶
手術刀 組織鑷 有軌振蕩器 培養皿 培養瓶 試管 濾網

步驟

一、材料

無菌

1. 基礎培養液：DMEM 和 F12 混合液 50：50

2. FBS（Sterile Systems, Hyclone)

3. 完全培養液：DMEM 和 F12 混合液，添加 10%FBS

4. BSS

5. 0.1% 膠原蛋白酶（IV 型，Worthington）和 0.1% 胰蛋白酶（1：250，Sigma）混合液，用 0.15mol/L NaCl 配制

6. 0.5 mg/ml DNase，用生理鹽水配制

7. 胰蛋白酶和 EDTA 混合液：用 0.1% 胰蛋白酶（1：250）和 1 mm/L EDTA(培養基，Sigma）配制

8. 手術刀和組織鑷

9. 孔徑為 160um 的 Nitex 濾網（Tetko）

10. 培養皿和培養瓶

11. 50 ml 試管

非滅菌

1. 有軌振蕩器（Bellco）

二、操作步驟

消化組織

1. 按冠狀面將腎切成 5~10 mm 厚的組織片。用冰冷的基礎培養液洗組織片。

2. 從皮質的外層切下組織，然后用十字刀片切成 1~2 mm 小塊。

3. 將約 5 ml 組織塊放入盛有預熱的 20 ml 膠原蛋白酶和胰蛋白酶混合液的 50 ml 試管。

4. 輕輕搖晃，孵育組織塊 1 h。

5. 吸除消化液，然后加入新鮮消化液。

6. 每隔 20 min 收集細胞懸液，然后加入 20 ml 含有 0.5 mg/ml DNase 的培養基礎液，用 10 ml 吸管輕輕研磨 10 轉。

7. 用等量的完全培養液稀釋收集的細胞懸液。將稀釋后的細胞懸液置于冰上。

8. 重復收集步驟 5 次或 5 次以上，直至組織塊被完全分散。

9. 將收集的細胞懸液混合，分裝如 50 ml 試管，

10. 離心（100 g，15 min）后，用 45 ml 含 DNase 的完全培養液混懸細胞。

11. 用孔徑為 160um 的 Nitex 濾網過濾細胞懸液。

12. 這種分離方法既分離到系抱團，又分離到單個細胞，故細胞計數不可靠。每個 75cm2培養瓶內放 15 ml 細胞懸液，細胞擴增后傳代培養或凍存。          

注意事項

1. 在原代培養初期，培養液的含量在3ML以下，最適宜的為1-1.5ML，僅夠保持植塊濕潤即可。

2. 在扔入垃圾前，應該用次氯酸鹽處理剩余組織和使用過的試管、吸管、培養皿。

3. 培養液需要在無菌的環境下才能打開，避免污染。

常見問題

腎小管上皮細胞的鑒定：將培養的腎小管上皮細胞置于放有蓋玻片的24孔培養版上，待細胞生長至占有培養面積約80%時，取出蓋玻片，PBS洗片。甲醇-20攝氏度固定5min，PBS洗片，加10%羊血清37℃封閉30min，PBS洗片，加兔抗人角蛋白18抗體，陰性對照PBS一抗，37℃反應1h，加FTTC標記的羊抗兔lgG（1:200），37℃避光反應45min， PBS洗片，90%甘油封片，熒光顯微鏡觀察染色結果。

NHK-C細胞顯著呈現近曲小管的功能特征，如受甲狀旁腺激素（parathy roid houmone，PTH)抑制的Na+依賴性無機磷轉運系統。另外NHK-C細胞轉運己糖，這種轉運對根皮苷敏感和具有Na+依賴性。NHK-C細胞的cAMP受激索刺激方式同近曲小管，即對PTH反應，對加壓素不敏感。這些細胞表達近曲小筲刷狀緣的酶（表芽糖酶、亮氨酸氨基酞酶和7-谷氨酰轉酞酶）。此外，NHK-C細胞用于研究磷酰基甲酸的特異性和Na+和 P同向轉運的抑制劑，并作為腎小管氧化劑損傷的模型。

來源：《動物細胞培養：基礎技術指南（第五版）》