方案20.2 復蘇凍存細胞實驗
原理
快速復蘇細胞,緩慢稀釋,以高細胞密度重新接種(圖20.9)。
材料與儀器
步驟
材料
無菌
培養瓶(如果需要離心時)
生長培養基
吸量管,1ml,10ml
注射器和19號針頭(如果你使用玻璃凍存管)
非滅菌
保護性手套和面罩
37℃無菌水,10cm深,盛于清潔、用乙醇擦拭過的帶蓋的水桶中
鑷子
70%乙醇
棉簽
1%萘黑(酰胺黑)或0.4%臺盼藍
操作步驟
1.檢查凍存目錄,確定將要復蘇的凍存管的位置
2.收集所有材料,準備培養基,標記培養瓶
3.從凍存罐中取出凍存管,檢查標簽,確定是否是所需要的凍存管,若小管未浸沒在液氮中,將小管放入塑料除菌水桶內37℃的燒杯中。盡可能避免水沒過官帽,因為會增加污染的機會。
安全提示
將凍存管從液氮中取出時,必須穿實驗衣,戴手套。若凍存管浸沒在液氮中,則必須待面罩或護目鏡,也必須穿實驗衣戴手套。儲存在液氮中的凍存管,包括塑料小管都可能吸入液氮,復蘇時將可能發生劇烈爆炸。該種情況下,必須使用帶蓋的塑料水桶進行復蘇,以控制爆炸。
4.當凍存管復蘇時,再次檢查標簽以確定為所需的細胞;隨后用70%乙醇徹底擦洗凍存管,然后在超凈工作臺內打開凍存管,
5.用1ml吸管將凍存管內含物轉移至培養瓶中。
6.將培養基緩慢的加至細胞懸液中:以每2min 10ml的速率進行滴加。開始時逐滴加入,然后可加快,逐漸稀釋細胞和細胞保護劑。
對于需要通過離心去除細胞保護劑的細胞:
(a)按照步驟6,在離心管或常規容器內緩慢稀釋細胞。
(b)100g離心2min。
(c)棄去含有細胞保護劑的上清培養液。
(d)以新鮮培養基重新懸浮細胞。
(e)接種入培養瓶。
7.凍存管內殘留物可用萘黑或臺盼藍染色,以測定細胞的存活率(見方案22.3.1)。
8.24h后檢查:
(a)對于貼壁單層細胞,依據預測密度(個細胞/cm2)的細胞照片,確認細胞是否貼壁,估計細胞存活率(見13.6.1節,16.4.5節;彩圖4)。
(b)對于懸浮生長的細胞,檢查外觀(清晰的細胞質,缺乏細胞顆粒),稀釋至常規的接種濃度。若進行細胞技術,并估計細胞存活率(見22.3.1節)后,接種濃度可能更精確,這種情況下, 可以將細胞稀釋至常規存活細胞接種濃度。
注意事項
1. 將凍存管從液氮中取出時,必須穿實驗衣,戴手套。若凍存管浸沒在液氮中,則必須待面罩或護目鏡,也必須穿實驗衣戴手套。儲存在液氮中的凍存管,包括塑料小管都可能吸入液氮,復蘇時將可能發生劇烈爆炸。該種情況下,必須使用帶蓋的塑料水桶進行復蘇,以控制爆炸。
2. 塑料凍存管在使用前要仔細檢查,以防管壁破裂或螺口不配套造成密封 不嚴。
3. 用DMSO作為凍存保護劑時,用前應先將凍存液在4℃預冷,解凍后應馬 上洗去保護劑。
常見問題
1. 檢查細胞活率。用1ml培養液重懸細胞,臺盼藍染料排除法檢查細胞存活率。
2. DMSO有劇毒,使用時要特別注意。此外,在凍存前越晚加入細胞越好,解凍后要盡快除去,以避免對細胞的毒害。
來源《動物細胞培養:基礎技術指南(第五版)》