基于 MTT 的細胞毒性實驗

原理

將指數生長期的細胞暴露在細胞毒性藥物中，暴露的持續時間通常決定于產生最大損傷所需的時間，但是它也受藥物穩定性的影響。將藥物撤除后，讓細胞再增殖 2~3 個群體倍增時間（PDT )，這樣就可以把能夠增殖的存活細胞與那些不能增殖的存活細胞區別開來。然后用 MTT 染料還原反應測定存活細胞的數目。只要 MTT—甲臜產物溶于適當溶劑中，就可以用分光光度法來定量。

材料與儀器

細胞樣品
胰蛋白酶 MTT Sorensen 甘氨酸緩沖液
微滴定板 微量吸頭 培養皿

步驟

材料：
無菌
生長液:
胰蛋白酶（0.25% + EDTA ，1 mmol/L ，溶于 PBSA 中）
MTT : 3-(4,5-二甲基-2-噻唑)-2, 5-二甲苯基溴化四唑，50 mg/m l, 濾過, 除菌。
Sorensen 甘氨酸緩沖液（0.1 mol/L 甘氨酸，0.1 mol/L, NaC l，用 1 mol/L Na(OH) 將 pH 調至 10.5)
微滴定板（Iwaki)
微量吸頭，最好放在高壓滅菌的吸頭盒中
5 cm 和 9 cm 培養皿（未經 T C 處理的）或儲液器（Corning)
30 ml 和 100 ml 通用容器或試管
 

非滅菌
塑料盒（無毒的聚苯乙烯，裝培養板用）
多道加樣器
二甲基亞砜 (DMSO) DMS( ) 分裝器:Labsystems Microplate Dispenser (Cat No 5840127，Thermo Electron)
ELISA 讀板儀（Molecular Devices，with SOFT max PRO ; 見附錄Ⅱ )
離心用的板架（用于懸浮生長的細胞）

操作步驟

接種細胞
1. 用胰蛋白酶消化匯合的單層細胞，將細胞收集到含血清的培養基中。
2. 離心細胞懸液（5 min ，200 g )，使細胞沉積下來。用培養基重懸細胞，計數。
3. 將細胞稀釋至 2.5 X103~50 X103 個/ml，這要依細胞系的生長速度而定，每個微滴定板可以容納 20 ml 細胞懸 液。
4. 將細胞懸液移至 9 cm 培養皿中，用多道加樣器在平底 96 孔板中間 10 列的各孔中加人 20 ul 細胞懸液（每板 80 孔），從第 2 列開始到第 11 列為止，每孔加入 0.5X 103~10X 103 個細胞
5. 將 200ul 培養基加至第 1 列與第 12 列的 8 個孔中。第 1 列用作讀板儀的空白對照，第 12 列有助于維持第 11 列的濕 度，并將「邊緣效應」（edge effect) 減至最小。
6. 將培養板放至塑料飯盒中，于 37℃：濕潤環境中溫育 1~3 d ，等細胞進入指數生長期時可加入藥物。
7. 對于非黏附細胞，用新鮮培養基制備細胞懸液，將細胞稀釋至每毫升 5X 103~100X 103 個/m l，僅取 100 ul 細胞 懸液接種于圓底 96 孔板，之后立即加入藥物。

添加藥物
8. 用培養基將細胞毒性藥物 5 倍系列稀釋，共制備 8 個濃度。選擇濃度時應以最高濃度下多數細胞被殺死，而最低 濃度時不會殺死細胞為標準。只要對藥物的毒性有所了解，便可采用較小的濃度范圍。一般情況下，每種藥物使 用 3 塊培養板，這樣一次試驗中可以有三個平行測定結果。
9. 對于貼壁生長的細胞，去除第 2-11 列各孔中的培養基，這可以通過將皮下注射器針連在吸引管上完成。
10. 在第 2 列和第 11 列的 8 個孔中加人 200^1 新鮮配制的培養基，這些細胞作為對照。
11. 在第 3~10 列的細胞中加入細胞毒性藥物。每個藥物濃度僅需 4 個孔，這樣 A-D 行可用于第一種藥物，E ~H 行用于第二種藥物。
12. 將藥物溶液移至 5 cm 培養皿中，用 4 道加樣器向每組的 4 個孔中各加入 200 ul。
13. 將培養板放回塑料盒中，溫育至確定的暴露時間。對于非黏附細胞，將藥 物稀釋至預期終濃度的 2 倍，取 100^1 加入已含 100^1 細胞的孔中。

生長期
14. 在藥物暴露期結束時，去除所有含有細胞的孔中的培養基，加入 200 ul 新鮮的培養基。若是非黏附細胞，離心培 養板（5 min ，200 g )，使細胞沉淀下來。然后用細針頭吸去培養基，不要擾動細胞團。
15. 每日換液至 2~3 個 P D T 。

存活細胞數的估算
16 . 在生長期末，每孔中各加人 200 ul 新鮮的培養基，在第 1-11 列所有孔中各加人 50 ul MTT 。
17. 以鋁箔包裹培養板，于 37℃濕潤環境中溫育 4 h 。請注意 4 h 是所需的最短溫育時間，可延至 8 h 。

18.. 棄去孔中的培養基和 (非黏附細胞則離心），在第 1-11 列所有孔中各加入 200ul DMSO , 以溶解殘留的 MTT - 甲臘結晶。
19. 在含 DMSO 的各孔中加人甘氨酸緩沖液（每孔 25 ul )。
20. 立即在 570 nm 處記錄吸光值，因為產物不穩定。讀板儀用第 1 列中含培養基和 MTT 但不含細胞的各孔調零。

MTT 試驗分析
21. 以藥物濃度為橫坐標（X 軸），吸光值為縱坐標（Y 軸）繪制曲線圖。
22. 第 2 列和第 11 列各孔中得出的平均吸光值作為對照吸光值，對照組吸光值減少一半時所需的藥物濃度為 IC50 濃 度。偶爾結果并非如此，這表明整個板中所接種的細胞數不一致之故。
23. 得到吸光值的絕對值，以此作圖，這樣才能與對照吸光值比較，然后要將數據轉化成百分率抑制曲線 (圖 22.6)， 從而使一系列曲線標準化。
 

注意事項

1. 嚴格進行消毒．使用三套器械取材。

2. 嚴格進行無菌操作，防止細菌、真菌、支原體污染，避免化學物質污染。

3. 吸取液體前，瓶口和吸管進行火焰消毒；經火焰消毒后的吸管一定要用Hank’S液冷卻。防止燙傷、燙死細胞。吸取液體時，避免瓶口和吸管接觸碰撞。