方案26.3 旋轉瓶培養

原理

將細胞懸液加入到圓形培養瓶中，然后將培養瓶放在旋轉架上緩慢轉動。

材料與儀器

D-PBSA 0.25%天然胰蛋白酶 單層細胞 二氧化碳
培養液和培養液容器 旋轉培養瓶 血細胞計數板或電子細胞計數器和計數用液體 旋轉架

步驟

1. 用胰蛋白酶消化細胞，以通常密度種植。

旋轉瓶中的氣相較大， 故用基于 Hanks 鹽和空氣氣相的培養基，可能需要向培養瓶內充入少量 5% CO2 （如 10 L/min，2 s）。如果培養液是用 CO2/HCO3 緩沖的， 氣相應該用 5% CO2 調整（20 L/min，30s~1 min，以瓶的大小決定）。

2. 將培養瓶放在旋轉架上，以 20 rph 的速度轉動，直至細胞貼壁（24~48 h ) 。

3. 細胞密度增大時，加快旋轉速度至 60~80 rph。

4. 給細胞加培養液或收集培養液時，可將培養瓶取到無菌工作區，如通常一樣排出培養液，然后更換新鮮培養液。假如體積不是關鍵問題，輸血裝置或培養液袋對于添加新鮮培養液是有用的。如果培養液容量至關重要，可用吸管滴加或用一個蠕動泵計量。

5. 收獲細胞：

(a)棄去培養液，用 50~100 ml D-PBSA 浸洗細胞，然后棄去 D-PBSA。

(b)在 4℃條件下，加入 50~100 ml 胰蛋白酶。用手或放在旋轉架上以 20 rpm 將培養瓶轉動 15 s。

(c)吸出胰蛋白酶，將培養瓶內的細胞消化 5~15 min，然后加入培養液。

(d)搖晃和轉動培養瓶，用滴管將細胞洗出。