Hoechst 33342 和 Rhodamine123 染色分析造血干細(xì)胞特征

簡介

Hoechst 33342 和 Rhodamine123 染色分析造血干細(xì)胞特征是鑒于體外活體染料 Rhodamine123 (Rh123) 和 Hoechst 33342 (Ho) 已經(jīng)被證實(shí)是分析原始造血干細(xì)胞 (PHSCs) 的特性，鑒定、分離和純化的十分有效的探針，將與干細(xì)胞密切相關(guān)的群體區(qū)分開來。目前，分析造血干細(xì)胞特征采用方法為 Hoechst 33342 和 Rhodamine123 染色。

原理

Hoechst 33342 和 Rhodamine123 染色分析造血干細(xì)胞特征的基本原理是 Rh123、Ho 單獨(dú)應(yīng)用或聯(lián)合應(yīng)用，能結(jié)合干細(xì)胞特定表面相關(guān)抗原、凝集素或其他體外活體染料一起分析，根據(jù)長期移植潛能、細(xì)胞周期動態(tài)和更新率、進(jìn)入細(xì)胞周期的細(xì)胞比率、細(xì)胞因子受體庫和基因表達(dá)模式、對細(xì)胞因子偏好、反應(yīng)性和體外克隆形成能力準(zhǔn)確地將小鼠原始造血干細(xì)胞按照發(fā)育的情況排序，將與干細(xì)胞密切相關(guān)的群體區(qū)分開來。

材料與儀器

器材：流式細(xì)胞儀、鏈霉親和素微珠。

試劑：

①Hoechst 33342 粉：用無菌蒸餾水配制 20 mM 儲存液，每管分裝 50ul，-20°C 冷凍保存。

②Rh123 粉：用甲醇配制 l0 mg/mL 儲存液，每管分裝 100ul，-20℃，冷凍保存。

步驟

造血干細(xì)胞特征分析的實(shí)驗(yàn)步驟如下：

（一）骨髓細(xì)胞收集

A. 切下股骨、脛骨和骼骨嵴，無菌外科手術(shù)刀刮掉附著的肌肉和組織。放入冷的 2% HiSe PBS 中。

B. 無菌研缽和碾槌碾碎骨頭，用 40um 尼龍細(xì)胞濾器過濾細(xì)胞懸液，去除骨碎片。

C. 在無菌的 50 mL 離心管中用等體積的 3 mg/mL 膠原酶和 3 mg/mL 分散酶，重懸骨碎片，置于 37℃ 定軌振蕩器孵育至少 5 min。向試管中加入 25 mL 2% HiSe PBS, 劇烈振搖，小心倒岀細(xì)胞懸液，通過 40um 尼龍細(xì)胞濾器過濾。再用 25 mL 2% HiSe PBS 重懸骨碎片，如前操作，小心倒出細(xì)胞懸液。

D. 在 4℃ 條件下,400 g 離心細(xì)胞懸液 5 min。用 2% HiSe PBS 重懸細(xì)胞。收集所有骨髓細(xì)胞離心，用過量 2% HiSe PBS 洗 2 次，調(diào)整細(xì)胞密度約 107/mL。

（二）低密度細(xì)胞收集

A. 在 50 mL 離心管中，將 20 mL 骨髓細(xì)胞懸液小心加在 10 mL 1.077 g/mL Nycoprep 分離液的表層。關(guān)閉離心機(jī)剎車，低溫離心（4℃ 條件下 600 g 離心 20 min）。

B. 在 Nycoprep 分離液界面收集低密度單個核細(xì)胞，加入過量的 2% HiSe PBS, 洗滌、離心 2 次，再重懸于 2% HiSe PBS, 并計(jì)數(shù)。

（三）免疫磁珠的陰性選擇

A. 分散低密度骨髓細(xì)胞，重懸并調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度至 l08/mL, 加入生物素直接標(biāo)記的 CD3, CD4 ,CD5 , CD8 , B220, Grl, Mac-1 和 TERI 19 抗原的組合抗體，冰上孵育 30 min。

B. 同時，另外準(zhǔn)備兩小份低密度骨髓細(xì)胞，作為 Lin-抗原參考設(shè)門。一份單獨(dú)加入 StreP-PE 孵育，另一份加入 StreP-PE 和與相關(guān)譜系抗體蛋白濃度相同的同型對照組合抗體。

C. 用過量 MACS 標(biāo)記緩沖液洗滌標(biāo)記細(xì)胞，離心（400 g 4℃ 離心 5 min）去除殘留的未結(jié)合的抗體。再在 MACS 標(biāo)記緩沖液中重懸細(xì)胞。

D. 細(xì)胞計(jì)數(shù)。取其中一小部分標(biāo)記細(xì)胞（2.5×105）加入 Strep-PE 孵育，作為 MACS 分選前對照，用于:①流式細(xì)胞對免疫磁珠陰性選擇的分選效果評價;②校正熒光補(bǔ)償設(shè)置;③設(shè)置分選門，將在 Hodull/Rhdull 細(xì)胞分離方法中污染的譜系陽性細(xì)胞排除在外。

E. 將剩余的細(xì)胞懸液再次離心（4℃ 條件下 400 g 離心 5 min）, 倒掉上清，留下干的細(xì)胞團(tuán)。

F. 再次用 90ul 標(biāo)記緩沖液和按每 107 細(xì)胞 10ul 鏈霉親和素微球標(biāo)記細(xì)胞。間歇攪拌，充分混勻，冰浴 15 min。

G. 微球孵育后，按每 107, 細(xì)胞用 1-2 mL MACS 分離緩沖液洗滌標(biāo)記細(xì)胞（4℃ 條件， 400 g 離心 5 min）。用 MACS 分離緩沖液重懸細(xì)胞，并將細(xì)胞濃度調(diào)整為 108/500ul。

H. 在抗體和微球標(biāo)記過程中, 選擇一個先前描述的合適的 MACS 分離柱，準(zhǔn)備安裝，按照提供的操作說明書介紹放在磁分離器中。

I. 把細(xì)胞懸液加入到洗滌后的分離柱中，把閥門打開至工作位置, 讓細(xì)胞最大程度地穿入至分離柱中。用相當(dāng)于 3-5 倍分離柱體積的 MACS 分離緩沖液洗滌分離柱, 收集磁珠陰選的細(xì)胞，即為造血干細(xì)胞譜系陰性細(xì)胞。

（四）Rh123 和 Ho 染色

A. 在低密度、譜系陰性細(xì)胞懸液中, 按每百萬細(xì)胞，加入每種熒光素 10ul, 輕輕攪勻細(xì)胞懸液, 在暗處 37 ℃ 水浴中孵育 30mim。

B.Rhl23 和 Ho 染色后，通過無染料緩沖液 37℃2 次孵育，根據(jù)細(xì)胞膜染料泵出活性，分離細(xì)胞。

C. 室溫離心 Rh123/Ho 染色細(xì)胞（400 g 離心 5 min）, 沉淀用預(yù)溫的無染料 5% HiSe PBS 懸浮細(xì)胞至 1 xl06/mL, 在暗處 37℃ 無水浴 15 min。

D. 離心沉淀細(xì)胞，重復(fù)染料泵出步驟 1 次。

E. 重復(fù)染料泵出步驟后，取出一部分 Rhl23/Ho 染色細(xì)胞（2.5 xl05）冰浴保存, 作為流 式細(xì)胞分析對照。

F.3.4.6 離心剩下的細(xì)胞懸液，用 Strep-PE 重懸細(xì)胞至濃度為 1 xl08/mL, 避光冰浴 30 min, 用來檢測殘留污染的譜系分化抗原陽性造血細(xì)胞。

G. 加入過量的 0.25% HiSe PBS, 離心細(xì)胞懸液，使細(xì)胞形成細(xì)胞團(tuán)，用 0.25% HiSe PBS 重懸細(xì)胞至（5-10）x 106/mL。加 7-AAD 貯存液（1：50 V/V）至終濃度為 2 ug/mL。將標(biāo)記細(xì)胞保存于冰上，為流式細(xì)胞分析和分選作準(zhǔn)備。