用流式細胞術檢測血小板相關抗體

原理

一種能夠通過胎盤存在于血小板表面的免疫球蛋白，被稱為血小板相關抗體（PA-IgG）。

材料與儀器

羊 F（ab+）2 2 IgG-PE 抗體 血樣
洗滌緩沖液
流式細胞儀

步驟

一、試劑

洗滌緩沖液（PBS/EDTA/BSA），PBS 緩沖液，含 10 mmol/L EDTA 和 0.5% BSA。

抗體：羊 F（ab+）2 抗-人 IgG（Fc Sp）-R-PE（H10104，Caltag 為多克隆抗體）。

陰性對照：羊 F（ab+）2 2 IgG-PE（11304，Caltag）。

二、樣本

正常人血樣 1 份，血小板數值在正常范圍，具體數目不詳。

患者血樣 2 份，為 1 個月齡的雙胞胎患者 1 和患者 2，均為貧血血小板，具體數目不詳。

三、步驟

1. 用含 EDTA 抗凝劑的血液收集管采血，3 個血樣均取 2 ml，分別加到 3 支流式標準管中。

2. 離心 500 r/min，將上清（富血小板血漿）轉到另外 3 支流式標準管中。

3. 離心 2500 r/min 3 min。吸去血漿，用與血漿等體積的洗滌緩沖液重懸血小板。如果必要，可用旋渦混合器混勻。

4. 用洗滌緩沖液洗滌血小板 3 次，每次離心 2500 r/min 3 min。

5. 適量洗滌緩沖液重懸血小板，用血球計數儀測定血小板的濃度，其中正常血樣血小板計數為 2000 /ul，患者 1 的血小板數為 6000 /ul，患者 2 的血小板數為 7000 /ul（稀釋濃度）。

6. 每個含重懸血小板的流式標準管分為兩管。A 管為檢測管，B 管為陰性對照管，共 6 只管。正常人血樣分別取 250 ul 于 2 支 流式標準管（A 管和 B 管）中，每管血小板總數為 5x106。分別取 80 ul 患者 1 的血樣于 2 支流式標準管（A 管和 B 管）中，每管血小板總數為 4.8x106。分別取 70 ul 患者 2 的血樣于 2 支流式標準管（A 管和 B 管）中，每管血小板總數為 4.9x106。

7. 將上述 6 支流式標準管，于 A 管均加 5 ul 羊 F（ab+）2 抗-人 IgG（Fc Sp），B 管均加 5 ul 羊 F（ab+）2 IgG。

8. 室溫，避光孵育 15 min。用洗滌緩沖液再洗 1 次，方法同步驟 4。

9. 去上清，加 0.5 ml 洗滌緩沖液重懸，上機分析。