單位重力沉降法純化四膜蟲細胞核

材料與儀器

細胞核
PMSF
培養基 有機玻璃容器

步驟

1. 準備細胞核。

2. 準備修訂培養基，當在冷的條件下強力混合培養基時，在所有修訂培養基中加入終濃度為 1 mmol/L 的 PMSF。

3. 用 H2O 按 1:1 稀釋 2% 修訂培養基 7.5 ml。

4. 將帶有夾子的柔性管連接到聚甲基丙烯酸甲酯有機玻璃容器底部的中心孔和帶一通閥的注射器上，另一邊也帶有夾子的柔性管連接到注射器的三通閥和梯度發生器上。

5. 裝置建立中所有管道是空的，夾子應夾上一確定梯度發生器貯液槽水平，活塞關閉。

6. 用 3% 和 6% 的修訂培養基裝滿梯度發生器的貯液槽，梯度將從 3% 到 6% 形成，所以要確定將 3% 修訂培養基放入梯度發生器的混合貯液槽中。先不要混合梯度。

7. 用 3% 的修訂培養基趕走梯度發生器和注射器之間管中的空氣，完成后夾上夾子。倒去注射器中的 3% 培養基。

8. 用 1% 的覆蓋液趕走注射器和聚甲基丙烯酸甲酯有機玻璃容器之間管中的空氣，當注射器空了后，夾上夾子。

9. 用吊桶式轉頭在 0~4℃ 將細胞核于 2000~3000 g 離心 5 分鐘。用 Dounce 勻漿器在 12~20 ml 2% 修訂培養基 A 中重懸。

10.將勻漿過的細胞核加入注射器中，打開夾子，讓細胞和緩慢流進容器中。

11. 加 2% 的修訂培養基到注射器中，將殘留的細胞核沖洗干凈。夾上夾子。

12. 將 3% 到 6% 的修訂培養基梯度注入聚甲基丙烯酸甲酯有機玻璃容器中。

13. 控制梯度流速，應足夠慢，以免容器中液體混合。

14. 當梯度完成后，夾上夾子。

15. 細胞核于 0~4℃ 在容器中安定 15~16 小時。

16. 用 50 ml 的圓錐形離心管收集組分，容器底部到頂部。

17. 1500 g 離心組分 10 分鐘。棄上清。攪拌片狀沉淀，重懸。

18. 甲基綠染色后，用顯微鏡分析組分。

19. 集合相近的組分，計數細胞核以作參考。