正常人肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)

實(shí)驗(yàn)材料：

1. 手術(shù)切除的正常肺組織

2. 胰蛋白酶/EDTA液：0.05%胰蛋白酶，0.5mmol/L EDTA

3. 6孔培養(yǎng)板：用多聚賴氨酸包被

4. 不含Ca2+ 和Mg2+ 的1×PBS（pH=7.4），添加200000IU/L青霉素、200mg/L鏈霉素和200000U/L慶大霉素，pH7.4

5. 手術(shù)刀、解剖剪、解剖鑷、眼科剪，眼科鑷

6. 離心管（15ml、50ml）

實(shí)驗(yàn)方法：

1. 將肺組織至于無(wú)菌的培養(yǎng)皿中用含雙抗的1×PBS（pH=7.4）清洗若干次至無(wú)明顯血細(xì)胞；

2. 剪取肺組織邊緣微血管豐富的組織，用含雙抗的1×PBS（pH=7.4）清洗兩次；

3. 將剪取的肺邊緣組織剪成2-3mm3 大小，加入含雙抗的1×PBS（pH=7.4）清洗；

4. 用進(jìn)行過(guò)滅菌處理的玻璃滴管將剪碎的組織塊和清洗用的1×PBS（pH=7.4）一起轉(zhuǎn)入15ml離心管中；

5. 250rpm/min離心2 min，小心傾去液體，再加入適量的含雙抗的1×PBS（pH=7.4），用玻璃滴管吹吸液體以清洗組織塊；

6. 繼續(xù)250rpm/min離心2 min，小心傾去液體，重復(fù)上述步驟若干次，直至離心后的液體中觀察不到明顯的紅色；

7. 將清洗好的組織塊重新轉(zhuǎn)至無(wú)菌的培養(yǎng)皿中，用無(wú)菌的200 ml的吸頭將組織塊貼于25cm2 培養(yǎng)瓶中；

8. 加入2ml培養(yǎng)基，將培養(yǎng)瓶倒置放于37℃、5%CO2 的培養(yǎng)箱中2-3h之后正置培養(yǎng)瓶繼續(xù)培養(yǎng)；

9. 培養(yǎng)若干天后，可觀察到組織塊周圍陸續(xù)有細(xì)胞爬出，繼續(xù)培養(yǎng)幾天，直至組織塊周圍的細(xì)胞達(dá)到較高密度（培養(yǎng)其間兩天換液一次，換液操作時(shí)動(dòng)作一定要輕柔，以防組織塊被搖下）；

10. 當(dāng)組織塊附近的細(xì)胞生長(zhǎng)到較高密度后，將貼壁的組織塊吹下，換新的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24；

11. 24h后，用0.25%的Trypsin-EDTA消化細(xì)胞，F(xiàn)BS中止消化，將消化后的細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)入15ml離心管，1000rpm/min離心5min，之后傾去廢液，用培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，轉(zhuǎn)入原來(lái)的培養(yǎng)瓶中，繼續(xù)在37℃、5%CO2 的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

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