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正常小鼠原代真皮纖維原細胞培養
發布日期:2023-07-04 09:30:47


正常小鼠原代真皮纖維原細胞培養


一、實驗試劑

1、培養基: PriCells Medium + 10% FBS + 1% P/S + PriCells Supplement

2、凍存液: PriCells Medium + 20% FBS + 10% DMSO

3、洗滌液: 1 × PBS (pH 7.4 )+ 1% P/S

4、染色液: 0.4% Trypan Blue

5、消化液: PriCells Isolation of Primary Cell Kit

6、檢測試劑:抗小鼠Fibronectin抗體,熒光標記二抗,乙醇丙酮混合液(1:1)

二、實驗器械

1、培養皿

2、培養瓶

3、直剪和眼科剪

4、眼科鑷

5、玻璃滴管

6、15ml離心管

7、200目網篩

三、實驗流程

取材

取皮片,削成厚度為0.5mm的皮片

皮片浸泡在75%酒精中消毒

1 × PBS (pH 7.4 )清洗皮片兩遍

皮片剪成(3-5)mm×(10-15)mm大小

置于消化液中4℃消化過夜

剝去表皮,并刮去真皮下的其他組織

將組織塊剪成1mm3 左右

加入消化液,37℃消化至消化液渾濁

停止消化,懸液過200目網篩

收集細胞懸液,800rpm離心5min

重懸細胞,重復離心一次

重懸細胞,Trypan Blue染色計數,以5×105 的數量接種于培養瓶中

37℃,5%CO2 培養

四、實驗操作

1、培養瓶預包被。試驗前一天預包培養瓶,置于超靜臺吹干或45℃烘箱烘干(切記保持無菌),4℃冰箱放置,備用。

2、取材:從小鼠身上取皮片,削成厚度為0.5mm左右的皮片;

3、材料預處理:將皮片浸泡在75%的酒精中消毒;用1 × PBS (pH 7.4 )清洗兩遍(每次約5min)以清除血細胞;

4、初步消化:將皮片剪成(3-5)mm×(10-15)mm大小,去除皮下組織;將裁剪好的皮塊置于消化液中4℃消化過夜;第二天,取出消化好的細胞,用鑷子盡可能剝去表皮,并刮去真皮下的其他組織;

5、再次消化:處理好后,將組織塊剪成1mm3 左右,加入消化液,37℃震蕩消化至消化液渾濁(1h左右);

6、中止消化:中止酶反應,懸液過200目網篩;

7、收集重懸細胞:收集細胞懸液,800rpm離心5min;棄上清,用培養基重懸細胞,重復離心一次;

8、細胞密度計數:培養基重懸細胞,0.4% Trypan Blue染色計數,以5×105 的數量接種于培養瓶中。

9、培養:放置于37℃,5% CO2 培養箱中。

五、細胞鑒定

1、顯微鑒定:相差顯微鏡下,可見細胞呈梭形或扁的星狀,具有突起。細胞具備良好的透光性。

2、免疫組織化學鑒定 :利用Fibronectin相關抗原檢測。

3、細胞爬片。將洗凈的蓋玻片放入6孔培養板中,接種細胞為3×104 個/孔,48小時候細胞可以長滿,用鑷子取出鋪滿細胞的蓋玻片備用。

4、細胞固定:用PBS洗滌細胞,之后放入乙醇丙酮混合液中,固定10min,空氣中自然干燥。

5、特異性抗體:按照說明書稀釋比要求稀釋抗體,加入抗體,放置37℃孵育60min。

6、洗滌:1 × PBS (pH 7.4 )洗滌3次 × 15 分鐘,晾干。

7、標記性抗體:加入熒光標記抗體,37℃孵育30min。

洗滌:1 × PBS (pH 7.4 )洗滌3次 × 15 分鐘,晾干。

8、封片:封片劑封片。

9、鏡檢:熒光顯微鏡下觀察。

六、注意事項

1、選材注意時要將皮膚組織上的被毛去除干凈,也可以使用還未長出被毛的乳鼠進行試驗。

2、注意盡量將皮片剪成(3-5)mm ×(10-15)mm大小,如太大則不利于消化,太小則不利于真皮、表皮的物理分離。

3、過度消化損傷嚴重影響成纖維細胞的生長,因此應嚴格掌握好酶的消化濃度和消化時間。

4、嚴格控制成纖維細胞的培養條件。包括細胞培養用液(培養基,生長因子,血清,抗生素)的質量,濃度。

5、關于培養瓶包被與否,有文獻研究顯示包被與未包被之間沒有特別大的差異。 實驗中,可以酌情考慮是否包被。

6、傳代培養細胞接種量為5×104 個(25 cm2 培養瓶),細胞倍增時間為48小時。細胞傳代培養最佳為4-7代, 傳代次數增加,細胞體積增大,細胞之間間隙增加,細胞貼壁牢固,傳代消化時間會有所延長。

七、 PriCells 細胞圖片



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