密度梯度細胞分離法

原理

制備密度梯度液，通過密度梯度液離心細胞，收集各梯度組分，用培養基稀釋，培養細胞。

材料與儀器

細胞樣品
D-PBS 0.25%胰蛋白酶
生長培養基生長培養基+20% Percoll 25ml離心管注射器或梯度收集器 24孔培養板折光儀或密度計低速離心機

步驟

通過下述方法之一制備密度梯度液：

(a)分層鋪放法：

(i)調整 Percoll 密度至 1.10 g/CC，滲透壓為 290 mOsm/kg 。

(ii)將 Penroll 與不同比例的常規培養基混合達到所需的密度范圍（例如，1.020~1.100 g/ml )，一般為 10 或 20 個級差。

(iii)在 25 ml 離心管中，用吸管、注射器和蠕動泵，每個密度取 1 ml 或 2 ml，從最高密度起，逐層地將一種密度液鋪放在另一層上，建立起一種階梯性密度梯度。也可以從低密度鋪起，用注射器或蠕動泵，將髙一級密度的溶液注射到上一級的下面。后一種方法也許更可取。

密度梯度液可以立即使用或放置過夜。

(b)使用梯度形成器：

一種連續性的線性梯度可以在梯度形成器里通過混合不同濃度的 Percoll 而實現。例如，在梯度發生器里混合 1.020 g/ml 及 1.080 g/cc 的 Percoll（Fisons、Pharmacia、Buchler）。

(c)離心法：

(i)在離心管中加人含密度為 1. 085 g/cc Percoll 的培養基。

(ii)20000 g 離心 1 h 。

(iii) 離心產生一個 S 型的密度梯度，其形狀是由 Percoll 的初始濃度、離心時間、離心力、離心管形狀以及離心方式所決定的。

1. 胰蛋白酶消化細胞，重新懸浮于加了血清或胰蛋白酶抑制劑的培養基中，確保是單細胞懸液。

2. 用一個注射器，移液管或末端纖細的吸管將含 2x107 個細胞的 2 ml 細胞懸液小心平鋪在梯度液的頂端。

3. 離心管直立在臺面上 4 h，讓細胞在 1 g 的狀態下自由沉降，或者在 100~1000 g 之間離心 20 min。如果用后一種方法，要在離心開始時逐漸地加大離心速度，并且在離心快要結束時不要人為制動。

4. 用一個注射器或梯度收集器（Fisons ) 收集細胞。1 ml 的最可以收集到一個 24 孔培養板中，0.1 ml 的量則收集于一個微滴定板上。每間隔一定時間應當取樣進行細胞計數及梯度液的密度（β）測定。密度測定可以使用折光儀（Hilger）或密度計（Paar）。

5. 每孔加入等體積的培養基，混勻以保證細胞能接觸孔的底部。培養 24~48 h 后，更換培養基以除去 Percoll。